Taime- ja patogeenmaterjalid
Sorgo assotsiatsioonide kaardistamise populatsiooni, mida tuntakse sorgo konversioonipopulatsioonina (SCP), pakkus välja dr Pat Brown Illinoisi Ülikoolist (nüüd UC Davis). Seda on varem kirjeldatud ja see on kogum erinevaid liine, mis on muundatud fotoperioodi suhtes tundetuks ja väiksemaks, et hõlbustada taimede kasvu ja arengut USA keskkonnas. Selles uuringus kasutati sellest populatsioonist 510 liini, kuigi halva idanemise ja muude kvaliteedikontrolli probleemide tõttu ei kasutatud kõiki liine kõigi kolme tunnuse analüüsimisel. Lõpuks kasutati kitiini vastuse analüüsimiseks 345 liini andmeid, flg22 vastuse analüüsimiseks 472 liini andmeid ja TLS-resistentsuse analüüsimiseks 456 liini andmeid.B. küpsistüvi LSLP18 saadi dr Burt Bluhmilt Arkansase Ülikoolist.
MAMP vastuse mõõtmine
Selles uuringus kasutati kahte erinevat MAMP-i: flg22 (Genscripti katalooginumber RP19986) ja kitiini. Sorgo taimi kasvatati kasvuhoones mullaga (33% Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix) täidetud kastmetel. Taimi kasteti päev enne proovi võtmist, et vältida kogumispäeval lehtede liigset niiskust.
Liinid randomiseeriti ja logistilistel põhjustel istutati 60 liini kaupa. Iga liini kohta istutati kolm „potti“, igas liinis kaks seemet. Järgmised partiid istutati kohe pärast eelmise partii töötlemist, kuni kogu populatsioon oli hinnatud. Mõlema MAMP-i jaoks viidi läbi kaks eksperimentaalset tsüklit, kusjuures genotüübid randomiseeriti ümber mõlemas tsüklis.
ROS-testid viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud. Lühidalt, igast liinist külvati kuus seemet kolme erinevasse potti. Saadud seemikutest valiti välja kolm ühtlikkuse põhjal. Seemikuid, mis nägid välja ebatavalised või olid enamikust oluliselt kõrgemad või lühemad, ei kasutatud. Kolme erineva 15-päevase sorgotaime neljanda lehe kõige laiemast osast lõigati välja neli 3 mm läbimõõduga lehelett. Üks ketas lehe kohta kahelt taimelt ja kaks ketast ühelt taimelt, kusjuures teine ketas sai veekontrolliks (vt allpool). Kettad hõljusid eraldi 50 µl H20 peal mustal 96-süvendilise plaadil, mis suleti alumiiniumtihendiga, et vältida valguse käes viibimist, ja hoiti toatemperatuuril üleöö. Järgmisel hommikul valmistati reaktsioonilahus, kasutades 2 mg/ml kemoluminestsents-sondi L-012 (Wako, katalooginumber 120-04891), 2 mg/ml mädarõika peroksidaasi (tüüp VI-A, Sigma-Aldrich, katalooginumber P6782) ja 100 mg/ml kitiini või 2 μM Flg22. 50 µl seda reaktsioonilahust lisati kolme neljast süvendist. Neljas süvend oli kontrollsüvend, kuhu lisati reaktsioonilahus ilma MAMP-ita. Igale plaadile lisati ka neli tühja süvendit, mis sisaldasid ainult vett.
Pärast reaktsioonilahuse lisamist mõõdeti luminestsentsi Synergy™ 2 mitmedetektorilise mikroplaadilugejaga (BioTek) iga 2 minuti järel 1 tunni jooksul. Plaadilugeja mõõdab luminestsentsi iga 2 minuti järel selle 1 tunni jooksul. Kõigi 31 näidu summa arvutati iga süvendi väärtuse saamiseks. Iga genotüübi MAMP-vastuse hinnanguline väärtus arvutati järgmiselt: (kolme eksperimentaalse süvendi keskmine luminestsentsi väärtus – kontrollsüvendi väärtus) - miinus keskmine tühja süvendi väärtus. Tühjade süvendite väärtused olid järjepidevalt nullilähedased.
LehtkettadNicotiana benthamianaKvaliteedikontrolli eesmärgil lisati igale 96-süvendilisele plaadile kontrollina ka üks kõrge reageerimisvõimega sorgo liin (SC0003) ja üks madala reageerimisvõimega sorgo liin (PI 6069).
B. küpsisInokulaadi ettevalmistamine ja inokuleerimine
B. küpsisInokulaat valmistati nagu eelnevalt kirjeldatud. Lühidalt, sorgoteri leotati vees kolm päeva, loputati, kallati 1-liitristesse koonilistesse kolbidesse ja autoklaaviti tund aega rõhul 15 psi ja temperatuuril 121 °C. Seejärel inokuleeriti teri umbes 5 ml värskelt kultuurilt saadud leotatud mütseeliga.B. küpsisLSLP18 isolaadid ja jäeti 2 nädalaks toatemperatuurile, loksutades kolbe iga 3 päeva tagant. 2 nädala pärast kuivatati seentega nakatunud sorgoterad õhu käes ja seejärel säilitati temperatuuril 4 °C kuni põllul inokuleerimiseni. Sama inokulaati kasutati kogu katse vältel ja see valmistati igal aastal värske. Inokuleerimiseks pandi 4–5 nädala vanuste sorgotaimede keerde 6–10 nakatunud tera. Nendest seentest toodetud eosed algatasid noorte sorgotaimede nakkuse nädala jooksul.
Seemnete ettevalmistamine
Enne põllule külvi töödeldi sorgo seemneid fungitsiidi, insektitsiidi ja taimekaitsevahendi seguga, mis sisaldas ~1% Spirato 480 FS fungitsiidi, 4% Sebring 480 FS fungitsiidi ja 3% Sorpro 940 ES seemnekaitsevahendit. Seejärel kuivatati seemneid 3 päeva õhu käes, mille tulemusel tekkis seemnete ümber õhuke kiht sellest segust. Taimekaitsevahend võimaldas kasutada herbitsiidi Dual Magnum tärkamiseelse töötlusena.
Sihtkoha lehelaikuse resistentsuse hindamine
SCP istutati Claytonis, Põhja-Carolinas asuvas Central Crops Research Stationis 14.–15. juunil 2017 ja 20. juunil 2018 randomiseeritud täisplokk-disaini abil, kusjuures mõlemal juhul tehti kaks katsekorda. Katsed istutati 1,8 m laiustesse üksikutesse ridadesse 0,9 m rea laiusega, kasutades 10 seemet proovilapi kohta. Iga katse perimeetri ümber istutati kaks äärisrida, et vältida servaefekte. Katsed inokuleeriti 20. juulil 2017 ja 20. juulil 2018, mil sorgotaimed olid 3. kasvufaasis. Hinnanguid anti skaalal üks kuni üheksa, kus haigustunnusteta taimi hinnati üheksa ja täielikult surnud taimi üheks. 2017. aastal tehti kaks hinnangut ja 2018. aastal neli mõõtmist, alustades igal aastal kaks nädalat pärast inokuleerimist. sAUDPC (haiguse progresseerumise kõvera standardiseeritud pindala) arvutati eelnevalt kirjeldatud viisil.
Postituse aeg: 01.04.2021