Pestitsiidid mängivad olulist rolli ülemaailmse toidupuuduse lahendamisel ja vektorite kaudu levivate haiguste vastu võitlemisel. Kasvav pestitsiidiresistentsuse probleem nõuab aga kiiresti uute ühendite avastamist, mis on suunatud alakasutatud sihtmärkidele. Putukate transientse retseptori potentsiaali (TRPV) kanalid – Nanzhong (Nan) ja inaktiivsed (Iav) – võivad moodustada heteroloogseid kanaleid (Nan-Iav) ja lokaliseeruda mehanosensorsetes organites, mis vahendavad putukatel geotropismi, kuulmist ja propriotseptsiooni. Mõned pestitsiidid, näiteks afidopürrolidoon (AP), sihivad Nan-Iav-i tundmatute mehhanismide kaudu. AP on efektiivne läbistavate-imevate putukate (hemipteraanide) vastu, takistades toitumist, häirides niitide funktsiooni. AP saab seonduda ainult Nan-iga, kuid ainult Nan-Iav saab suhelda agonistidega, sealhulgas endogeense nikotiinamiidiga (NAM), omades seeläbi kanali aktiivsust. Vaatamata Nan-Iav potentsiaalile insektitsiidi sihtmärgina on selle kanalite struktuuri, regulatiivsete seondumiskohtade ja Ca2+-sõltuva regulatsiooni kohta vähe teada, mis takistab edasist insektitsiidide väljatöötamist. Selles uuringus kasutati krüoelektronmikroskoopiat, et määrata Nan-Iav struktuuri Hemiptera putukates kalmoduliini ligandivabas olekus, samuti AP ja NAM-iga anküriini korduse tsütoplasmaatilise domeeni (ARD) piiril. Üllataval kombel leidsime, et Nan-valk ise võib moodustada pentameeri, mida stabiliseerivad AP-vahendatud ARD interaktsioonid. See uuring paljastab insektitsiidide ja agonistide ning Nan-Iav molekulaarsed interaktsioonid, rõhutades ARD olulisust kanalite funktsioonis ja kokkupanekus ning uurides Ca2+ regulatsiooni mehhanismi.
Üha tõsisemate globaalsete kliimamuutuste taustal on halvenev ülemaailmne toiduga kindlustatus 21. sajandi üks peamisi väljakutseid, millel on ühiskonnale laiaulatuslikud tagajärjed.1,2Maailma Terviseorganisatsiooni aruandes „Toiduga kindlustatuse ja toitumise olukord maailmas 2023. aastal” (SOFI) hinnatakse, et ligikaudu 2,33 miljardit inimest kogu maailmas kannatab mõõduka kuni raske toiduga kindlustamatuse all, mis on pikaajaline probleem.3,4Kahjuks kaotab kahjurite ja patogeenide tõttu igal aastal hinnanguliselt 20–30% või rohkem põllukultuuride saagist ning eeldatakse, et globaalne soojenemine süvendab kahjurite vastupanuvõimet ja põllukultuuride haavatavust.4, 5, 6, 7, 8Pestitsiidide väljatöötamine on kriitilise tähtsusega mitte ainult põllukultuuride kaitsmiseks kahjurite eest ja vektorite kaudu levivate patogeenide leviku vähendamiseks, vaid ka vektorite kaudu levivate inimeste haiguste, näiteks denguepalaviku, malaaria ja Chagase tõve vastu võitlemiseks, mis on pestitsiidide suhtes üha resistentsemad.5, 9, 10, 11
Neurotoksiliste insektitsiidide peamiste sihtmärkide hulgas on heterotetrameerne TRPV kanal Nanchung (Nan) -Inactive (Iav), mis esindab insektitsiidide sihtmärkide klassi, mis avastati alles viimase kümnendi jooksul, sealhulgas kaubanduslikult saadaval olevad insektitsiidid nagu imidaklopriid ja püraklostrobiin.12, 13, 14Poolsünteetiline insektitsiid afidopürrolifeen (AP) on hiljuti väljatöötatud ja turustatud toode, mille peamine komponent on aktiivne insektitsiid Inscalis®, mis seondub AP-ga subnanomolaarse aktiivsuse tasemel.15AP-l on tolmeldajate, kasulike putukate ja teiste mittesihtorganismide suhtes madal äge toksilisus ning kui seda kasutatakse vastavalt etiketil olevatele juhistele, võib see vähendada resistentsussurvet teiste insektitsiidide suhtes.16, 17, 18Nan ja Iav on putukaliikide vahel laialt levinud, neid ekspresseeritakse koos ainult antennide ja jäsemete akordivenitusretseptorite neuronites ning nad on kriitilise tähtsusega kuulmise, gravitatsiooni tajumise ja propriotseptsiooni jaoks.13, 16, 19, 20, 21, 22AP, imidaklopriid ja püraklostrobiin stimuleerivad Nan-Iav kompleksi ainulaadse mehhanismi kaudu, mis lõppkokkuvõttes pärsib propriotseptiivset signaaliülekannet.13, 16, 23Torkavate imevate putukate (hemipteraliste), näiteks lehetäide ja valgekärbeste puhul, kahjustab propriotseptsiooni kadu nende toitumisvõimet, mis viib lõpuks surmani.13,24Huvitaval kombel on AP-l kõrge afiinsus Nan-Iav kompleksi ja madal afiinsus ainult Nani suhtes. AP seondumine Nan-Iav-ga kutsub esile elektrivoolu, kuid ainult Nani-ga seondumine ei stimuleeri kanali aktiivsust. Iav ise ei seondu AP-ga üldse.16See viitab sellele, et Nan ja Iav võivad seonduda, moodustades erinevaid Nan-Iav kanalikomplekse (nt erinevate stöhhiomeetriliste suhetega või erineva paigutusega sama stöhhiomeetrilise suhte piires) või et AP võib seonduda mitme saidiga. Lisaks seondub looduslik agonist nikotiinamiid (NAM) Drosophila Nan-Iav-ga mikromolaarse afiinsusega, avaldades in vitro sarnaseid efekte lehetäide (AP) omadega.16,25ja pärsib lehetäide paljunemist ja toitumist, mis viib lõpuks nende surmani25,26Need andmed tekitavad palju küsimusi. Näiteks jääb selgusetuks, kuidas Nan-Iav heterodimeer moodustub, milliseid seondumiskohti kasutatakse väikeste molekulide moduleerimiseks ja kuidas need väikesed molekulid reguleerivad kanali funktsiooni, pärssides propriotseptsiooni. Lisaks jäävad selgusetuks põhjused, miks Nan ise on inaktiivne ja omab AP suhtes madalat afiinsust, samas kui Nan-Iav heterodimeer on aktiivne ja seondub AP-ga suurema afiinsusega. Lõpuks on vähe teada Nan-Iav funktsiooni Ca2+-sõltuvast regulatsioonist ja sellest, kuidas see on integreeritud neuronaalsetesse signaalimisprotsessidesse.13,21
Selles uuringus, mis ühendas krüoelektronmikroskoopia, elektrofüsioloogia ja radioligandi sidumise tehnikad, selgitasime välja Nan-Iav struktuuri ja selle seondumise mehhanismi väikemolekuliliste regulaatoritega. Lisaks tuvastasime Iav-ga konstitutiivselt seotud kalmoduliini (CaM) ja AP-stabiliseeritud Nan-pentameerid. Need tulemused annavad olulist teavet kaltsiumiioonide regulatsiooni, kanali struktuuri ja ligandi sidumise afiinsust määravate tegurite kohta. Veelgi olulisem on see, et kinnitasime, et ARD-l on nendes protsessides keskne roll. Meie uuring täielike putukakanalite seondumisest asjakohaste põllumajanduslike pestitsiididega27, 28, 29avab pestitsiiditööstuse arenguväljavaateid, parandades pestitsiidide tõhusust ja spetsiifilisust ning võimaldades TRPV-vastaste ühendite kasutamist teiste liikide puhul, et lahendada ülemaailmse toiduga kindlustatuse ja vektorite kaudu levivate haiguste leviku probleeme.
Samuti leidsime, et Nan-Iav-i reguleerib Ca2+ ja regulatsioonimehhanismi vahendab konstitutiivselt seotud CaM. Oluline on see, et see Ca2+-sõltuv Nav-i regulatsioon CaM-i poolt erineb oluliselt teiste ioonkanalite (nt pingega juhitavate Na+ kanalite ja TRPV5/6 kanalite) regulatsioonimehhanismidest.52, 53, 54, 55, 56, 57Nav1.2 kanalis seostub CaM-i C-terminaalne domeen spiraalselt C-terminaalse domeeniga (CTD) ja Ca2+ indutseerib selle N-terminaalse domeeni seondumise CTD distaalse osaga.56TRPV5/6 kanalis seondub CaM-i C-terminaalne domeen CTH-ga ja Ca2+ indutseerib selle N-terminaalse domeeni ülespoole laienemist pooridesse, blokeerides seeläbi katioonide läbilaskvust.53,54Pakume välja mudeli Nan-Iav-CaM Ca2+-reguleeritud funktsiooni jaoks (joonis 4h). Selles mudelis seondub CaM-i N-terminaalne domeen konstitutiivselt Iav C-terminaalse domeeniga (CTH). Puhkeolekus (madal [Ca2+] kontsentratsioon) interakteerub CaM-i C-terminaalne domeen Nan-iga, stabiliseerides ARD konformatsiooni ja soodustades seeläbi kanali avanemist. Agonisti/insektitsiidi seondumine kanaliga kutsub esile pooride avanemise, mis viib Ca2+ sissevooluni. Seejärel seondub Ca2+ CaM-iga, põhjustades C-terminaalse domeeni dissotsiatsiooni Nani ARD-st. Kuna CaM-i sidumise blokeerimine kaotab sisuliselt Ca2+ inhibeeriva toime, moduleerib see dissotsiatsioon ARD liikuvust, põhjustades seeläbi Ca2+-sõltuvat inhibitsiooni või desensibiliseerumist. Kanalivoolude kiire taastumine pärast kaltsiumiioonide elueerimist (joonis 4g) viitab sellele, et see mehhanism hõlbustab kiiret reageerimist Ca2+-vahendatud neuronaalsetele signaalidele. Lisaks on teatatud, et Iav C-terminaalne piirkond, mis on siiani halvasti mõistetav, mängib kanali sihtimisel ja voolu regulatsioonis ka muid rolle.21
Lõpuks esitleb meie uuring põllumajandusliku tähtsusega insektitsiidi-insektitsiidi TRP-kanali kompleksi kõrge eraldusvõimega struktuuri – avastus, mis oli meile varem tundmatu. Märkimisväärselt iseloomustasime putukakanali struktuuri ja funktsiooni inimese rakkudes (HEK293S GnTi–), mitte putukarakkudes. Kasvava insektitsiidiresistentsuse ja jätkuva surve tõttu toiduga kindlustatusele ning patogeenidele annab meie töö olulist teavet, mis hõlbustab uute insektitsiidide väljatöötamist inimeste tervise ja ülemaailmse toiduga kindlustatuse hüvanguks. Uuringud on näidanud, et sellised insektitsiidid nagu AP on mõnede kahjurite vastu tõhusad, kui neid kasutatakse vastavalt etiketil olevatele juhistele, ning neil on madal äge toksilisus kasulikele tolmeldajatele, mis näitab nende keskkonnaohutust.13,16Lisaks on mõnede AP derivaatide testimine sääskedel näidanud, et nad kaotavad lõpuks oma lennuvõime. Nende moduleerivate ühendite Nan-Iav-ga seondumise mõistmine hõlbustab olemasolevate ühendite modifitseerimist või uute ühendite väljatöötamist tõhusamate jatäpnekahjuritõrje. Meie uuring näitab, et Nan-Iav ARD liides on kriitilise tähtsusega mitte ainult endogeensete ühendite, pestitsiidide ja Ca2+-CaM aktiivsuse reguleerimiseks, vaid ka kanalite kokkupanekuks. Pakume välja, et heterodimeeride kokkupaneku häirimine väikeste molekulidega võib olla ainulaadne ja paljutõotav lähenemisviis ioonkanalite inhibiitorite väljatöötamiseks.
Kaheksast ortoloogsest geenist valiti välja pruunmardika (Halyomorpha halys) täispikad geenid Nanchung ja Inactive, mis näitasid detergentides suurepärast stabiilsust. Sünteesitud geenid optimeeriti koodonite poolest inimese ekspressiooniks ja klooniti pBacMam pCMV-DEST vektorisse (Life Technologies), kasutades XhoI ja EcoRI restriktsioonisaite. See tagas, et kloonid olid raamis C-terminaalsete GFP-FLAG-10xHis ja mCherry-FLAG-10xHis märgistega, mida lõhustab HRC-3C proteaas (PPX), võimaldades sõltumatutväljendNanchungi ja Inactive'i kloonimiseks pBacMam vektorisse kasutati järgmisi praimereid:
Individuaalsete osakeste mikroskoopilised kujutised saadi Titan Krios G2 transmissioon-elektronmikroskoobiga (FEI), mis oli varustatud K3 kaamera ja Gatan BioQuantum energiafiltriga. Mikroskoopi töödeldi pingel 300 keV, energia seadistusega 20 eV, proovi piksli suurusega 1,08 Å/piksel (nimisuurendus 81 000x) ja defokuseerimisgradiendiga vahemikus -0,8 kuni -2,2 μm. Videosalvestus tehti kiirusega 40 kaadrit sekundis, kasutades Latitude S mikroskoopi (Gatan), nimidoosikiirusega 25 e–px−1 s−1, säriajaga 2,4 s ja kogudoosiga ligikaudu 60 e–Å−2.
Kiire indutseeritud liikumise korrektsioon ja doosi kaalumine viidi läbi filmil, kasutades MotionCor2 programmi RELION 4.061-s. Kontrastsuse ülekandefunktsiooni (CTF) parameetri hindamine viidi läbi cryoSPARC-is, kasutades plaastripõhist CTF hindamise meetodit62. Mikrofotod, mille CTF sobitamise resolutsioon oli ≥4 Å, jäeti järgnevast analüüsist välja. Tavaliselt kasutati cryoSPARC-is punktide valimiseks 500–1000 mikrofoto alamhulka, millele järgnes pärast filtreerimist mitu 2D klassifitseerimise vooru, et saada selge võrdluspilt mallipõhiseks osakeste valikuks. Seejärel ekstraheeriti osakesed 64-piksliste piiravate kastide ja 4-kordse liigitamise abil. Soovimatute osakeste kategooriate eemaldamiseks viidi läbi mitu 2D klassifitseerimise vooru. Esialgne 3D-mudel rekonstrueeriti ab initio rekonstrueerimise abil ja täpsustati cryoSPARC-is ebaühtlase täpsustamise abil. 3D-klassifikatsioon viidi läbi cryoSPARC-is või RELION-is ARD heterogeensuse põhjal. Membraanidomeenide olulist heterogeensust ei täheldatud. Osakesi täpsustati C1 ja C2 meetodite abil; Kõrgema C2 resolutsiooniga osakesi peeti C2 suhtes sümmeetrilisteks ja imporditi Bayesi täpsustamiseks RELION-i. Seejärel viidi osakesed tagasi cryoSPARC-i lõplikuks ebaühtlaseks ja lokaalseks täpsustamiseks. Lõplik resolutsioon ja osakeste arv on näidatud tabelis 1.
Nan+AP pentameeride töötlemisel uurisime mitmesuguseid meetodeid membraanidomeenide (eriti pooride piirkonna) eraldusvõime parandamiseks, näiteks signaali lahutamist ja TMD maskeerimist. Need katsed ebaõnnestusid aga pooride piirkonna potentsiaalselt äärmise korratuse ja TMD üldise heterogeensuse tõttu. Lõplik eraldusvõime arvutati cryoSPARC-i ebaühtlase töötlusmeetodi poolt automaatselt genereeritud maski abil, mis oli suunatud peamiselt ARD piirkonnale. Sellega saavutati oluliselt kõrgem eraldusvõime kui membraanidomeenide (eriti VSLD piirkonna) puhul.
Nanchungi ja inaktiivsete putukate apo vormide esialgsed de novo mudelid genereeriti esmalt Coot63 abil ning Nani ja Iav putukate mudelid genereeriti AlphaFold264 abil, et tuvastada madala usaldusnivooga piirkondi. Kalmoduliini modelleerimine põhines Ca2+-sidumis- ja Ca2+-vabade mudelite jäiga keha sobitustel vastavalt PDB juurdepääsunumbritega 4JPZ56 ja 1CFD65. Mudelid täpsustati sfäärilise täpsustamise abil, et tagada õige stereokeemia ja hea geomeetria. Seejärel modelleeriti fosfatidüülkoliin, fosfatidüületanoolamiin ja fosfatidüülseriin täpselt määratletud lipiiditihedustena ning NAM- ja AP-ligandid paigutati vastavatesse tihedustesse tihedates ühenduskohtades. Piirangufailid genereeriti isovormide SMILES-striidest, kasutades eLBOW-d PHENIX66-s. Lõpuks täpsustati mudeleid reaalruumis PHENIX-is, kasutades lokaalset võrguotsingut ja globaalset minimeerimist sekundaarstruktuuri piirangutega. Mudeli täpsustamiseks ja struktuurianalüüsiks kasutati MolProbity serverit ning illustratsioonid tehti PyMOL-i ja UCSF Chimera X-i abil.67,68,69 Ava analüüs viidi läbi HOLE-serveri70 abil ja järjestuse säilitamise kaardistamine viidi läbi Consurf-serveri71 abil.
Statistiline analüüs viidi läbi Igor Pro 6.2, Excel Office 365 ja GraphPad Prism 7.0 abil. Kõik kvantitatiivsed andmed on esitatud keskmisena ± standardviga (SEM). Kahe rühma võrdlemiseks kasutati Studendi t-testi (kahesuunaline, paaritu). Mitme rühma võrdlemiseks kasutati ühesuunalist dispersioonanalüüsi (ANOVA), millele järgnes Dunnetti post hoc test. *P< 0,05, **P< 0,01 ja ***P< 0,001 peeti statistiliselt oluliseks, olenevalt andmete jaotusest. Kd ja Ki väärtused ning nende asümmeetrilised 95% usaldusvahemikud arvutati GraphPad Prism 10 abil.
Lisateavet uuringu metoodika kohta leiate selles artiklis lingitud loodusportfelli aruande kokkuvõttest.
Esialgne mudel ehitati PDB 4JPZ ja 1CFD andmebaasidest pärit kalmoduliinimudeleid kasutades. Koordinaadid on deponeeritud valgu andmepanka (PDB) juurdepääsunumbrite 9NVN (Nan-Iav-CaM ilma ligandita), 9NVO (nikotiinamiidiga seotud Nan-Iav-CaM), 9NVP (nikotiinamiidi ja EDTA-ga seotud Nan-Iav-CaM), 9NVQ (afenidoolpürrooli ja kaltsiumiga seotud Nan-Iav-CaM), 9NVR (afenidoolpürrooli ja EDTA-ga seotud Nan-Iav-CaM) ja 9NVS (afenidoolpürrooliga seotud Nan-pentameer) all. Vastavad krüoelektronmikroskoopia pildid on deponeeritud elektronmikroskoopia andmebaasis (EMDB) järgmiste registreerimisnumbrite all: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM ilma ligandita), EMD-49845 (Nan-Iav-CaM kompleks nikotiinamiidiga), EMD-49846 (Nan-Iav-CaM kompleks nikotiinamiidi ja EDTA-ga), EMD-49847 (Nan-Iav-CaM kompleks afidoppürrooli ja kaltsiumiga), EMD-49848 (Nan-Iav-CaM kompleks afidoppürrooli ja EDTA-ga) ja EMD-49849 (Nan-pentameeri kompleks afidoppürrooliga). Funktsionaalanalüüsi algandmed on esitatud selles artiklis.
Postituse aeg: 28. jaanuar 2026