Ussirohi N,N-dietüül-m-toluamiid (DEET) on teatatud, et see pärsib AChE-d (atsetüülkoliinesteraasi) ja omab potentsiaalselt kantserogeenseid omadusi liigse vaskularisatsiooni tõttu. Selles artiklis näitame, et DEET stimuleerib spetsiifiliselt endoteelirakke, mis soodustavad angiogeneesi, suurendades seeläbi kasvaja kasvu. DEET aktiveerib angiogeneesile viivaid rakuprotsesse, sealhulgas proliferatsiooni, migratsiooni ja adhesiooni. See on seotud suurenenud NO tootmise ja VEGF ekspressiooniga endoteelirakkudes. M3 vaigistamine või farmakoloogiliste M3 inhibiitorite kasutamine kõrvaldas kõik need mõjud, mis viitab sellele, et DEET-indutseeritud angiogenees on M3-tundlik. Katsed, mis hõlmavad kaltsiumi signaaliülekannet M3-retseptoreid üleekspresseerivates endoteeli- ja HEK-rakkudes, samuti seondumis- ja dokkimisuuringud näitavad, et DEET toimib M3-retseptorite allosteerilise modulaatorina. Lisaks pärsib DEET AChE-d, suurendades seeläbi atsetüülkoliini biosaadavust ja selle seondumist M3-retseptoritega ning tugevdades proangiogeenset toimet allosteerilise regulatsiooni kaudu.
Primaarsed endoteelirakud (EC-d) eraldati Šveitsi hiirte aordist. Ekstraheerimismeetod kohandati Kobayashi protokollist26. Hiire endoteelirakke kultiveeriti EBM-2 söötmes, millele oli lisatud 5% kuumusega inaktiveeritud FBS-i, kuni neljanda passaažini.
Kahe DEET-i kontsentratsiooni mõju HUVEC-i, U87MG või BF16F10 proliferatsioonile analüüsiti CyQUANT rakkude proliferatsiooni analüüsi komplekti (Molecular Probes, C7026) abil. Lühidalt, 96-süvendilisele plaadile külvati 5,103 rakku süvendi kohta, lasti neil üleöö kinnituda ja seejärel töödeldi DEET-iga 24 tundi. Pärast kasvukeskkonna eemaldamist lisati mikrotiiterplaadi igasse süvendisse värvaine sidumise lahus ja inkubeeriti rakke temperatuuril 37 °C 30 minutit. Fluorestsentsi tasemed määrati Mithras LB940 multimoodse mikrotiiterplaadi lugejaga (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Saksamaa), mis oli varustatud 485 nm ergastusfiltrite ja 530 nm emissioonfiltritega.
HUVEC külvati 96-süvendilistesse plaatidesse tihedusega 104 rakku süvendi kohta. Rakke töödeldi DEET-iga 24 tundi. Rakkude elujõulisust hinnati kolorimeetrilise MTT testi abil (Sigma-Aldrich, M5655). Optilise tiheduse väärtused saadi multimoodse mikroplaadilugejaga (Mithras LB940) lainepikkusel 570 nm.
DEET-i mõjusid uuriti in vitro angiogeneesi testide abil. Töötlemine 10-8 M või 10-5 M DEET-iga suurendas kapillaaride pikkuse moodustumist HUVEC-ides (joonis 1a, b, valged tulbad). Võrreldes kontrollrühmaga näitas ravi DEET-i kontsentratsioonidega vahemikus 10-14 kuni 10-5 M, et kapillaaride pikkus saavutas platoo 10-8 M DEET-i juures (lisajoonis S2). DEET-iga kontsentratsioonide vahemikus 10-8 M ja 10-5 M töödeldud HUVEC-ide in vitro proangiogeenses efektis ei leitud olulist erinevust.
DEET-i mõju neovaskularisatsioonile määramiseks viisime läbi in vivo neovaskularisatsiooni uuringud. 14 päeva pärast näitasid hiired, kellele süstiti 10-8 M või 10-5 M DEET-iga eelkultiveeritud endoteelirakke, hemoglobiinisisalduse olulist suurenemist (joonis 1c, valged tulbad).
Lisaks uuriti DEET-indutseeritud neovaskularisatsiooni U87MG ksenotransplantaadiga hiirtel, kellele süstiti iga päev (ip) DEET-i annuses, mis teadaolevalt indutseerib plasmakontsentratsiooni 10-5 M, mis on normaalne avatud inimestel. 23-s uuringus täheldati tuvastatavaid kasvajaid (st kasvajaid >100 mm3) 14 päeva pärast U87MG rakkude süstimist hiirtele. 28. päeval oli kasvaja kasv DEET-iga töödeldud hiirtel kontrollhiirtega võrreldes oluliselt suurenenud (joonis 1d, ruudud). Lisaks näitas kasvajate CD31 värvimine, et DEET suurendas oluliselt kapillaaride pindala, kuid mitte mikroveresoonte tihedust (joonis 1e–g).
Muskariiniretseptorite rolli määramiseks DETA-indutseeritud proliferatsioonis kasutati 10-8 M või 10-5 M DETA-d pFHHSiD (10-7 M, selektiivne M3-retseptori antagonist) juuresolekul. HUVEC-i töötlemine. pFHHSiD blokeeris DETA proliferatiivsed omadused täielikult kõigis kontsentratsioonides (tabel 1).
Nendes tingimustes uurisime ka seda, kas DEET suurendaks HUVEC-rakkude kapillaaride pikkust. Sarnaselt ennetas pFHHSiD oluliselt DEET-i poolt indutseeritud kapillaaride pikkuse suurenemist (joonis 1a, b, hallid tulbad). Lisaks viidi sarnased katsed läbi M3 siRNA-ga. Kuigi kontroll-siRNA ei olnud kapillaaride moodustumise soodustamisel efektiivne, kaotas M3 muskariini retseptori vaigistamine DEET-i võime kapillaaride pikkust suurendada (joonis 1a, b, mustad tulbad).
Lisaks blokeeris pFHHSiD täielikult nii 10-8 M kui ka 10-5 M DEET-indutseeritud vaskularisatsiooni in vitro ja neovaskularisatsiooni in vivo (joonis 1c, d, ringid). Need tulemused näitavad, et DEET soodustab angiogeneesi raja kaudu, mis on tundlik selektiivsete M3 retseptori antagonistide või M3 siRNA suhtes.
AChE on DEET-i molekulaarne sihtmärk. Ravimid, näiteks donepesiil, mis toimivad AChE inhibiitoritena, võivad stimuleerida endoteeli angiogeneesi in vitro ja hiire tagajäsemete isheemiamudelites14. Testisime kahe DEET-i kontsentratsiooni mõju AChE ensüümi aktiivsusele HUVEC-is. Madal (10-8 M) ja kõrge (10-5 M) DEET-i kontsentratsioon vähendasid endoteeli AChE aktiivsust võrreldes kontrolltingimustega (joonis 2).
Mõlemad DEET-i kontsentratsioonid (10-8 M ja 10-5 M) vähendasid atsetüülkoliinesteraasi aktiivsust HUVEC-idel. Atsetüülkoliinesteraasi inhibiitorite kontrollina kasutati BW284c51 (10-5 M). Tulemused on väljendatud AChE aktiivsuse protsendina HUVEC-idel, mida töödeldi kahe DEET-i kontsentratsiooniga, võrreldes vehiikliga töödeldud rakkudega. Väärtused on väljendatud kuue sõltumatu katse keskmisena ± SEM. *p < 0,05 võrreldes kontrollrühmaga (Kruskal-Wallis ja Dunni mitmekordne võrdlustest).
Lämmastikoksiid (NO) osaleb angiogeneesi protsessis33, seega uuriti NO tootmist DEET-stimuleeritud HUVEC-ides. DEET-iga töödeldud endoteeli NO tootmine oli kontrollrakkudega võrreldes suurenenud, kuid saavutas olulisuse alles annuse 10-8 M juures (joonis 3c). DEET-indutseeritud NO tootmist kontrollivate molekulaarsete muutuste määramiseks analüüsiti eNOS-i ekspressiooni ja aktivatsiooni Western blot analüüsi abil. Kuigi DEET-ravi ei muutnud eNOS-i ekspressiooni, suurendas see oluliselt eNOS-i fosforüülimist selle aktiveerivas kohas (Ser-1177), vähendades samal ajal selle inhibeerivas kohas (Thr-495) võrreldes töötlemata rakkudega eNOS-i fosforüülimisel (joonis 3d). Lisaks arvutati fosforüülitud eNOS-i suhe aktivatsioonisaidil ja inhibeerivas kohas pärast fosforüülitud eNOS-i koguse normaliseerimist ensüümi koguhulka. See suhe oli iga DEET-i kontsentratsiooniga töödeldud HUVEC-ides oluliselt suurenenud võrreldes töötlemata rakkudega (joonis 3d).
Lõpuks analüüsiti VEGF-i, mis on üks peamisi proangiogeenseid faktoreid, ekspressiooni Western blot analüüsi abil. DEET suurendas oluliselt VEGF-i ekspressiooni, samas kui pFHHSiD blokeeris selle ekspressiooni täielikult.
Kuna DEET-i toimed on tundlikud nii M3-retseptorite farmakoloogilise blokaadi kui ka allareguleerimise suhtes, testisime hüpoteesi, et DEET võib suurendada kaltsiumi signaaliülekannet. Üllataval kombel ei suutnud DEET suurendada tsütoplasmaatilist kaltsiumi HUVEC-is (andmeid pole esitatud) ega HEK/M3-s (joonis 4a, b) kummagi kasutatud kontsentratsiooni puhul.
Postituse aeg: 30. detsember 2024