Anthelmintiline ravim N,N-dietüül-m-toluamiid (DEET) on teatatud, et see pärsib AChE-d (atsetüülkoliinesteraasi) ja sellel on liigse vaskularisatsiooni tõttu potentsiaalsed kantserogeensed omadused. Selles artiklis näitame, et DEET stimuleerib spetsiifiliselt endoteelirakke, mis soodustavad angiogeneesi, suurendades seeläbi kasvaja kasvu. DEET aktiveerib rakuprotsesse, mis põhjustavad angiogeneesi, sealhulgas proliferatsiooni, migratsiooni ja adhesiooni. Seda seostatakse suurenenud NO tootmise ja VEGF ekspressiooniga endoteelirakkudes. M3 vaigistamine või farmakoloogiliste M3 inhibiitorite kasutamine kaotas kõik need mõjud, mis viitab sellele, et DEET-indutseeritud angiogenees on M3 suhtes tundlik. Katsed, mis hõlmavad kaltsiumi signaaliülekannet M3-retseptoreid üleekspresseerivates endoteeli- ja HEK-rakkudes, samuti seondumis- ja dokkimisuuringud näitavad, et DEET toimib M3-retseptorite allosteerilise modulaatorina. Lisaks inhibeerib DEET AChE-d, suurendades seeläbi atsetüülkoliini biosaadavust ja selle seondumist M3 retseptoritega ning suurendades allosteerilise regulatsiooni kaudu proangiogeenset toimet.
Primaarsed EC-d eraldati Šveitsi hiirte aordist. Ekstraheerimismeetod kohandati Kobayashi protokollist 26 . Hiire EC-sid kultiveeriti EBM-2 söötmes, millele oli lisatud 5% kuumusega inaktiveeritud FBS-i kuni neljanda passaažini.
DEET kahe kontsentratsiooni mõju HUVEC, U87MG või BF16F10 proliferatsioonile analüüsiti CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026) abil. Lühidalt, 5,103 rakku süvendi kohta külvati 96-süvendilisele plaadile, lasti üleöö kinnituda ja seejärel töödeldi DEET-ga 24 tundi. Pärast kasvusöötme eemaldamist lisage mikroplaadi igasse süvendisse värvainet siduv lahus ja inkubeerige rakke 37 °C juures 30 minutit. Fluorestsentsi tasemed määrati, kasutades Mithras LB940 mitmemoodilist mikroplaadilugejat (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Saksamaa), mis oli varustatud 485 nm ergastusfiltritega ja 530 nm emissioonifiltritega.
HUVEC külvati 96 süvendiga plaatidele tihedusega 104 rakku süvendi kohta. Rakke töödeldi DEET-ga 24 tundi. Rakkude elujõulisust hinnati kolorimeetrilise MTT testiga (Sigma-Aldrich, M5655). Optilise tiheduse väärtused saadi mitmemoodilise mikroplaadi lugejaga (Mithras LB940) lainepikkusel 570 nm.
DEET-i mõju uuriti in vitro angiogeneesi testide abil. 10-8 M või 10-5 M DEET-ga töötlemine suurendas kapillaaride pikkuse teket HUVEC-des (joonis 1a, b, valged tulbad). Võrreldes kontrollrühmaga näitas ravi DEET-i kontsentratsioonidega vahemikus 10-14 kuni 10-5 M, et kapillaaride pikkus saavutas platoo 10-8 M DEET juures (täiendav joonis S2). DEET-ga töödeldud HUVEC-de in vitro proangiogeenses toimes kontsentratsioonivahemikus 10–8 M ja 10–5 M olulist erinevust ei leitud.
DEET-i mõju neovaskularisatsioonile määramiseks viisime läbi in vivo neovaskularisatsiooniuuringud. 14 päeva pärast ilmnes 10-8 M või 10-5 M DEET-ga eelkultiveeritud endoteelirakkudega hiirtel hemoglobiinisisalduse oluline tõus (joonis 1c, valged tulbad).
Lisaks uuriti DEET-indutseeritud neovaskularisatsiooni U87MG ksenotransplantaadiga hiirtel, kellele süstiti iga päev (ip) DEET-d annuses, mis teadaolevalt indutseerib plasmakontsentratsioone 10–5 M, mis on normaalne eksponeeritud inimestel. 14 päeva pärast U87MG rakkude süstimist hiirtele täheldati tuvastatavaid kasvajaid (st kasvajaid >100 mm3). 28. päeval paranes kasvaja kasv oluliselt DEET-ravi saanud hiirtel võrreldes kontrollhiirtega (joonis 1d, ruudud). Lisaks näitas kasvajate CD31 värvimine, et DEET suurendas oluliselt kapillaaride pindala, kuid mitte mikroveresoonte tihedust. (joon. 1e–g).
Muskariiniretseptorite rolli määramiseks DETA-indutseeritud proliferatsioonis kasutati 10-8 M või 10-5 M DETA-d pFHHSiD (10-7 M, selektiivne M3 retseptori antagonist) juuresolekul. HUVEC-i ravi. pFHHSiD blokeeris täielikult DETA proliferatiivsed omadused kõigil kontsentratsioonidel (tabel 1).
Nendel tingimustel uurisime ka seda, kas DEET suurendab HUVEC rakkudes kapillaaride pikkust. Samamoodi takistas pFHHSiD oluliselt DEET-indutseeritud kapillaaride pikkust (joonised 1a, b, hallid tulbad). Lisaks viidi sarnased katsed läbi M3 siRNA-ga. Kuigi kontroll-siRNA ei olnud kapillaaride moodustumise soodustamisel tõhus, kaotas M3 muskariiniretseptori vaigistamine DEET-i võime suurendada kapillaaride pikkust (joonised 1a, b, mustad ribad).
Lisaks blokeeris pFHHSiD täielikult nii 10-8 M või 10-5 M DEET-indutseeritud vaskularisatsiooni in vitro ja neovaskularisatsiooni in vivo (joonised 1c, d, ringid). Need tulemused näitavad, et DEET soodustab angiogeneesi selektiivsete M3 retseptori antagonistide või M3 siRNA suhtes tundliku raja kaudu.
AChE on DEET-i molekulaarne sihtmärk. Sellised ravimid nagu donepesiil, mis toimivad AChE inhibiitoritena, võivad stimuleerida EC angiogeneesi in vitro ja hiire tagajäseme isheemia mudelites14. Testisime kahe DEET-i kontsentratsiooni mõju AChE ensüümi aktiivsusele HUVEC-is. Madalad (10-8 M) ja kõrged (10-5 M) DEET kontsentratsioonid vähendasid endoteeli AChE aktiivsust võrreldes kontrolltingimustega (joonis 2).
Mõlemad DEET-i kontsentratsioonid (10-8 M ja 10-5 M) vähendasid atsetüülkoliinesteraasi aktiivsust HUVEC-is. Atsetüülkoliinesteraasi inhibiitorite kontrollina kasutati BW284c51 (10-5 M). Tulemused on väljendatud protsendina AChE aktiivsusest HUVEC-il, mida on töödeldud kahe DEET-i kontsentratsiooniga, võrreldes kandjaga töödeldud rakkudega. Väärtused on väljendatud kuue sõltumatu katse keskmisena ± SEM. *p < 0,05 võrreldes kontrolliga (Kruskal-Wallise ja Dunni mitmekordne võrdlustest).
Lämmastikoksiid (NO) osaleb angiogeenses protsessis 33, seetõttu uuriti NO tootmist DEET-stimuleeritud HUVEC-des. DEET-ga töödeldud endoteeli NO produktsioon suurenes võrreldes kontrollrakkudega, kuid saavutas tähtsuse ainult 10-8 M annuse juures (joonis 3c). DEET-indutseeritud NO tootmist kontrollivate molekulaarsete muutuste määramiseks analüüsiti eNOS-i ekspressiooni ja aktiveerimist Western blot analüüsiga. Kuigi DEET-ravi ei muutnud eNOS-i ekspressiooni, suurendas see oluliselt eNOS-i fosforüülimist selle aktiveerivas kohas (Ser-1177), vähendades samal ajal selle inhibeerivat saiti (Thr-495) võrreldes töötlemata rakkudega eNOS-i fosforüülimisel (joonis 3d). Lisaks arvutati fosforüülitud eNOS-i suhe aktiveerimiskohas ja inhibeerivas kohas pärast fosforüülitud eNOS-i koguse normaliseerimist ensüümi koguhulgasse. See suhe suurenes oluliselt iga DEET-i kontsentratsiooniga töödeldud HUVEC-ides võrreldes töötlemata rakkudega (joonis 3d).
Lõpuks analüüsiti VEGF-i, mis on üks peamisi proangiogeenseid tegureid, ekspressiooni Western blot analüüsiga. DEET suurendas oluliselt VEGF ekspressiooni, samas kui pFHHSiD blokeeris selle ekspressiooni täielikult .
Kuna DEET-i toimed on tundlikud nii M3-retseptorite farmakoloogilise blokaadi kui ka allareguleerimise suhtes, testisime hüpoteesi, et DEET võib suurendada kaltsiumi signaaliülekannet. Üllataval kombel ei suutnud DEET suurendada tsütoplasma kaltsiumi sisaldust HUVEC-is (andmeid pole näidatud) ja HEK/M3-s (joonis 4a, b) mõlema kasutatud kontsentratsiooni korral.
Postitusaeg: 30. detsember 2024