Selles uuringus uuriti kombineeritud ravi stimuleerivat toimettaimekasvuregulaatoridUuriti (2,4-D ja kinetiini) ja raudoksiidi nanoosakeste (Fe₃O₄-NP-de) mõju in vitro morfogeneesile ja sekundaarsete metaboliitide tootmisele *Hypericum perforatum* L.-s. Optimeeritud töötlus [2,4-D (0,5 mg/l) + kinetiin (2 mg/l) + Fe₃O₄-NP-d (4 mg/l)] parandas oluliselt taimede kasvuparameetreid: taime kõrgus suurenes 59,6%, juurte pikkus 114,0%, pungade arv 180,0% ja kalluse värske kaal 198,3% võrreldes kontrollrühmaga. See kombineeritud töötlus suurendas ka regeneratsiooni efektiivsust (50,85%) ja suurendas hüperitsiini sisaldust 66,6%. GC-MS analüüs näitas hüperosiidi, β-patoleeni ja tsetüülalkoholi suurt sisaldust, mis moodustas 93,36% piigi kogupindalast, samas kui fenoolide ja flavonoidide kogusisaldus suurenes koguni 80,1%. Need tulemused näitavad, et taimekasvuregulaatorid (PGR) ja Fe₃O₄ nanoosakesed (Fe₃O₄-NP-d) avaldavad sünergistlikku efekti, stimuleerides organogeneesi ja bioaktiivsete ühendite akumuleerumist, mis on paljulubav strateegia ravimtaimede biotehnoloogiliseks täiustamiseks.
Naistepuna (Hypericum perforatum L.), tuntud ka kui naistepuna, on mitmeaastane rohttaim naistepunaliste (Hypericaceae) perekonnast, millel on majanduslik väärtus.[1] Selle potentsiaalsete bioaktiivsete komponentide hulka kuuluvad looduslikud tanniinid, ksantoonid, floroglütsinool, naftaleendiantroon (hüperiin ja pseudohüperiin), flavonoidid, fenoolhapped ja eeterlikud õlid.[2,3,4] Naistepuna saab paljundada traditsiooniliste meetoditega; traditsiooniliste meetodite hooajalisus, seemnete madal idanemine ja vastuvõtlikkus haigustele piiravad aga selle potentsiaali ulatuslikuks kasvatamiseks ja sekundaarsete metaboliitide pidevaks moodustamiseks.[1,5,6]
Seega peetakse in vitro koekultuuri tõhusaks meetodiks taimede kiireks paljundamiseks, iduplasma ressursside säilitamiseks ja ravimühendite saagikuse suurendamiseks [7, 8]. Taimekasvuregulaatoritel (PGR) on oluline roll morfogeneesi reguleerimisel ning need on vajalikud kalluse ja tervete organismide in vitro kultiveerimiseks. Nende kontsentratsioonide ja kombinatsioonide optimeerimine on nende arenguprotsesside edukaks lõpuleviimiseks ülioluline [9]. Seetõttu on regulaatorite sobiva koostise ja kontsentratsiooni mõistmine oluline naistepuna (H. perforatum) kasvu ja regeneratsioonivõime parandamiseks [10].
Raudoksiidi nanoosakesed (Fe₃O₄) on nanoosakeste klass, mida on või arendatakse koekultuuri jaoks. Fe₃O₂-l on märkimisväärsed magnetilised omadused, hea biosobivus ning võime soodustada taimede kasvu ja vähendada keskkonnastressi, mistõttu on see pälvinud koekultuuride disainimisel märkimisväärset tähelepanu. Nende nanoosakeste potentsiaalsete rakenduste hulka võivad kuuluda in vitro kultuuri optimeerimine rakkude jagunemise soodustamiseks, toitainete omastamise parandamiseks ja antioksüdantsete ensüümide aktiveerimiseks [11].
Kuigi nanoosakestel on näidatud head taimekasvu soodustavat mõju, on uuringuid Fe₃O₄ nanoosakeste ja optimeeritud taimekasvuregulaatorite kombineeritud kasutamise kohta *H. perforatum* puhul vähe. Selle teadmiste lünga täitmiseks hindas käesolev uuring nende kombineeritud mõju in vitro morfogeneesile ja sekundaarsete metaboliitide tootmisele, et pakkuda uusi teadmisi ravimtaimede omaduste parandamiseks. Seetõttu on sellel uuringul kaks eesmärki: (1) optimeerida taimekasvuregulaatorite kontsentratsiooni, et tõhusalt soodustada kalluse moodustumist, võrsete taastumist ja juurdumist in vitro; ja (2) hinnata Fe₃O₄ nanoosakeste mõju kasvuparameetritele in vitro. Tulevikuplaanide hulka kuulub regenereeritud taimede ellujäämismäära hindamine aklimatiseerumise ajal (in vitro). Eeldatakse, et selle uuringu tulemused parandavad oluliselt *H. perforatum* mikropaljundamise efektiivsust, aidates seeläbi kaasa selle olulise ravimtaime säästvale kasutamisele ja biotehnoloogilistele rakendustele.
Selles uuringus saime lehtede eksplantaate põllul kasvatatud üheaastastelt naistepuna taimedelt (emataimed). Neid eksplantaate kasutati in vitro kultuuritingimuste optimeerimiseks. Enne kultiveerimist loputati lehti põhjalikult voolava destilleeritud vee all mitu minutit. Seejärel desinfitseeriti eksplantaatide pinnad, kastes need 30 sekundiks 70% etanooli ja seejärel 10 minutiks 1,5% naatriumhüpokloriti (NaOCl) lahusesse, mis sisaldas mõnda tilka Tween 20. Lõpuks loputati eksplantaate kolm korda steriilse destilleeritud veega enne järgmisse söötmesse üleviimist.
Järgmise nelja nädala jooksul mõõdeti võrsete taastumise parameetreid, sealhulgas taastumiskiirust, võrsete arvu eksplantaadi kohta ja võrse pikkust. Kui taastunud võrsed saavutasid vähemalt 2 cm pikkuse, viidi need juurdumiskeskkonda, mis koosnes poolenisti lahjendatud MS-keskkonnast, 0,5 mg/l indoolvõihappest (IBA) ja 0,3% guarkummist. Juurutamiskultuuri jätkati kolm nädalat, mille jooksul mõõdeti juurdumiskiirust, juurte arvu ja juurte pikkust. Iga töötlust korrati kolm korda, kultiveerides 10 eksplantaati korduse kohta, saades töötluse kohta ligikaudu 30 eksplantaati.
Taime kõrgust mõõdeti sentimeetrites (cm), kasutades joonlauda, taime tüvest kuni kõrgeima lehe tipuni. Juure pikkust mõõdeti millimeetrites (mm) kohe pärast seemikute ettevaatlikku eemaldamist ja kasvukeskkonna eemaldamist. Pungade arv eksplantaadi kohta loendati otse igal taimel. Lehtedel olevate mustade täppide ehk sõlmede arv mõõdeti visuaalselt. Arvatakse, et need mustad sõlmed on hüperitsiini sisaldavad näärmed ehk oksüdatiivsed laigud ja neid kasutatakse taime ravivastuse füsioloogilise indikaatorina. Pärast kogu kasvukeskkonna eemaldamist mõõdeti seemikute värsket kaalu elektroonilise kaaluga milligrammi (mg) täpsusega.
Kalluse moodustumise kiiruse arvutamise meetod on järgmine: pärast eksplantaatide nelja nädala pikkust kultiveerimist keskkonnas, mis sisaldab erinevaid kasvuregulaatoreid (kinaasid, 2,4-D ja Fe3O4), loendatakse kallust moodustada võimeliste eksplantaatide arv. Kalluse moodustumise kiiruse arvutamise valem on järgmine:
Iga töötlust korrati kolm korda, iga kordusega uuriti vähemalt 10 eksplantaati.
Taastumise määr peegeldab kalluskoe osakaalu, mis pärast kalluse moodustumise etappi edukalt läbib pungade diferentseerumisprotsessi. See näitaja näitab kalluskoe võimet transformeeruda diferentseerunud koeks ja kasvada uuteks taimeorganiteks.
Juurdumiskoefitsient on juurdumisvõimeliste okste arvu ja okste koguarvu suhe. See näitaja peegeldab juurdumisfaasi edukust, mis on mikropaljundamisel ja taimede paljundamisel ülioluline, kuna hea juurdumine aitab seemikutel kasvutingimustes paremini ellu jääda.
Hüperitsiiniühendid ekstraheeriti 90% metanooliga. 50 mg kuivatatud taimset materjali lisati 1 ml metanoolile ja sonikeeriti 20 minutit sagedusel 30 kHz ultrahelipuhastis (mudel A5120-3YJ) toatemperatuuril ja pimedas. Pärast sonikeerimist tsentrifuugiti proovi kiirusel 6000 p/min 15 minutit. Supernatant koguti ja hüperitsiini neeldumist mõõdeti lainepikkusel 592 nm, kasutades Plus-3000 S spektrofotomeetrit Conceiçao jt [14] kirjeldatud meetodi kohaselt.
Enamik taimekasvuregulaatorite (PGR) ja raudoksiidi nanoosakestega (Fe₃O₄-NP) töötlusi ei kutsunud esile mustade sõlmede moodustumist regenereerunud võrselehtedel. Sõlmi ei täheldatud üheski töötluses 0,5 või 1 mg/l 2,4-D, 0,5 või 1 mg/l kinetiini ega 1, 2 või 4 mg/l raudoksiidi nanoosakestega. Mõned kombinatsioonid näitasid sõlmede arengu kerget suurenemist (kuid mitte statistiliselt olulist) kinetiini ja/või raudoksiidi nanoosakeste suuremate kontsentratsioonide korral, näiteks 2,4-D (0,5–2 mg/l) kombinatsioon kinetiiniga (1–1,5 mg/l) ja raudoksiidi nanoosakestega (2–4 mg/l). Need tulemused on näidatud joonisel 2. Mustad sõlmed esindavad hüperitsiinirikkaid näärmeid, mis esinevad nii looduslikult kui ka on kasulikud. Selles uuringus seostati musti sõlmesid peamiselt kudede pruunistumisega, mis viitab soodsale keskkonnale hüperitsiini akumuleerumiseks. Töötlemine 2,4-D, kinetiini ja Fe₃O₄ nanoosakestega soodustas kalluse kasvu, vähendas pruunistumist ja suurendas klorofülli sisaldust, mis viitab paranenud metaboolsele funktsioonile ja oksüdatiivse kahjustuse potentsiaalsele vähenemisele [37]. See uuring hindas kinetiini mõju koos 2,4-D ja Fe₃O₄ nanoosakestega naistepuna kalluse kasvule ja arengule (joonis 3a–g). Varasemad uuringud on näidanud, et Fe₃O₄ nanoosakestel on seenevastane ja antimikroobne toime [38, 39] ning koos taimekasvuregulaatoritega kasutamisel võivad need stimuleerida taimede kaitsemehhanisme ja vähendada rakkude stressi indekseid [18]. Kuigi sekundaarsete metaboliitide biosüntees on geneetiliselt reguleeritud, sõltub nende tegelik saagis suuresti keskkonnatingimustest. Ainevahetus- ja morfoloogilised muutused võivad mõjutada sekundaarsete metaboliitide taset, reguleerides spetsiifiliste taimegeenide ekspressiooni ja reageerides keskkonnateguritele. Lisaks võivad indutseerijad käivitada uute geenide aktiveerimise, mis omakorda stimuleerivad ensümaatilist aktiivsust, aktiveerides lõpuks mitmeid biosünteesi radasid ja viies sekundaarsete metaboliitide moodustumiseni. Lisaks näitas teine uuring, et varju vähendamine suurendab päikesevalguse käes viibimist, tõstes seeläbi päevast temperatuuri *Hypericum perforatum* looduslikus elupaigas, mis aitab samuti kaasa hüperitsiini saagikuse suurenemisele. Nende andmete põhjal uuris käesolev uuring raua nanoosakeste rolli potentsiaalsete indutseerijatena koekultuuris. Tulemused näitasid, et need nanoosakesed võivad ensümaatilise stimulatsiooni kaudu aktiveerida hesperidiini biosünteesiga seotud geene, mis viib selle ühendi suurenenud akumuleerumiseni (joonis 2). Seega võib võrreldes looduslikes tingimustes kasvavate taimedega väita, et selliste ühendite tootmist in vivo saab suurendada ka siis, kui mõõdukas stress kombineeritakse sekundaarsete metaboliitide biosünteesis osalevate geenide aktiveerimisega. Kombineeritud ravil on üldiselt positiivne mõju regeneratsioonikiirusele, kuid mõnel juhul see mõju nõrgeneb. Märkimisväärselt võib ravi 1 mg/L 2,4-D, 1,5 mg/L kinaasi ja erinevate kontsentratsioonidega suurendada regeneratsioonikiirust sõltumatult ja oluliselt 50,85% võrreldes kontrollrühmaga (joonis 4c). Need tulemused viitavad sellele, et nanohormoonide spetsiifilised kombinatsioonid võivad sünergiliselt toimida taimede kasvu ja metaboliitide tootmist soodustades, millel on suur tähtsus ravimtaimede koekultuuri jaoks. Palmer ja Keller [50] näitasid, et 2,4-D-töötlus võis iseseisvalt indutseerida kalluse moodustumist St. perforatumis, samas kui kinaasi lisamine suurendas oluliselt kalluse moodustumist ja regeneratsiooni. See efekt oli tingitud hormonaalse tasakaalu paranemisest ja rakkude jagunemise stimuleerimisest. Bal jt [51] leidsid, et Fe₃O₄-NP-töötlus võis iseseisvalt parandada antioksüdantsete ensüümide funktsiooni, soodustades seeläbi juurte kasvu St. perforatumis. Kultiveerimiskeskkond, mis sisaldas Fe₃O₄ nanoosakesi kontsentratsioonides 0,5 mg/l, 1 mg/l ja 1,5 mg/l, parandas linataimede regeneratsioonikiirust [52]. Kinetiini, 2,4-diklorobensotiasolinooni ja Fe₃O₄ nanoosakeste kasutamine parandas oluliselt kalluse ja juurte moodustumise kiirust, kuid tuleb arvestada nende hormoonide kasutamise võimalike kõrvaltoimetega in vitro regeneratsioonis. Näiteks võib 2,4-diklorobensotiasolinooni või kinetiini pikaajaline või suure kontsentratsiooniga kasutamine põhjustada somaatilist klonaalset varieeruvust, oksüdatiivset stressi, ebanormaalset kalluse morfoloogiat või klaasistumist. Seega ei ennusta kõrge regeneratsioonikiirus tingimata geneetilist stabiilsust. Kõiki regenereeritud taimi tuleks hinnata molekulaarsete markerite (nt RAPD, ISSR, AFLP) või tsütogeneetilise analüüsi abil, et määrata nende homogeensust ja sarnasust in vivo taimedega [53,54,55].
See uuring näitas esmakordselt, et taimekasvuregulaatorite (2,4-D ja kinetiin) kombineeritud kasutamine Fe₃O₄ nanoosakestega võib suurendada morfogeneesi ja peamiste bioaktiivsete metaboliitide (sealhulgas hüperitsiini ja hüperosiidi) akumuleerumist *Hypericum perforatum'is*. Optimeeritud raviskeem (1 mg/l 2,4-D + 1 mg/l kinetiini + 4 mg/l Fe₃O₄-NP-sid) mitte ainult ei maksimeerinud kalluse moodustumist, organogeneesi ja sekundaarsete metaboliitide saagist, vaid näitas ka kerget indutseerivat toimet, mis potentsiaalselt parandas taime stressitaluvust ja meditsiinilist väärtust. Nanotehnoloogia ja taimekoekultuuri kombinatsioon pakub jätkusuutlikku ja tõhusat platvormi meditsiiniliste ühendite laiaulatuslikuks in vitro tootmiseks. Need tulemused sillutavad teed tööstuslikele rakendustele ja edasistele uuringutele molekulaarsete mehhanismide, annuse optimeerimise ja geneetilise täpsuse valdkonnas, sidudes seeläbi ravimtaimede fundamentaaluuringud praktilise biotehnoloogiaga.
Postituse aeg: 12. detsember 2025