Võrse apikaalse meristeemi (SAM) kasv on varre arhitektuuri jaoks kriitiline. Taimsed hormoonidgiberelliinid(GA) mängivad võtmerolli taimede kasvu koordineerimisel, kuid nende roll SAM-is on endiselt halvasti mõistetav. Siin töötasime välja GA signaaliülekande ratiomeetrilise biosensori, konstrueerides DELLA valgu, et pärssida selle olulist regulatiivset funktsiooni GA transkriptsioonivastuses, säilitades samal ajal selle lagunemise GA tuvastamisel. Näitame, et see lagunemisel põhinev biosensor registreerib arenduse ajal täpselt muutused GA tasemetes ja raku tuvastamises. Kasutasime seda biosensorit GA signaaliülekande aktiivsuse kaardistamiseks SAM-is. Näitame, et kõrged GA signaalid esinevad peamiselt rakkudes, mis asuvad elundi primordiate vahel, mis on sõlmedevaheliste rakkude eelkäijad. Kasutades funktsiooni suurendamise ja kaotamise lähenemisviise, demonstreerime lisaks, et GA reguleerib rakkude jagunemise tasapinna orientatsiooni, luues sõlmedevahelise kanoonilise rakulise korralduse, edendades seeläbi SAM-is sõlmedevahelist spetsifikatsiooni.
Võrse apikaalne meristeem (SAM), mis asub võrse tipus, sisaldab tüvirakkude niši, mille tegevus genereerib külgmised organid ja tüvesõlmed modulaarselt ja iteratiivselt kogu taime eluea jooksul. Kõik need korduvad üksused või taimesõlmed sisaldavad sõlmedevahelisi ja külgmisi organeid sõlmedes ning aksillaarseid meristeeme lehtede kaenlas1. Taimesõlmede kasv ja korraldus muutub arengu käigus. Arabidopsis on vegetatiivses staadiumis sõlmedevaheline kasv alla surutud ja kaenlaalused meristeemid jäävad rosettlehtede kaenlasse seisma. Lillefaasi üleminekul muutub SAM õisiku meristeemiks, tekitades piklikke sõlmevahesid ja kaenlaaluseid pungi, harusid õielehtede kaenlas ja hiljem lehtedeta õisi2. Kuigi oleme teinud märkimisväärseid edusamme lehtede, lillede ja okste teket kontrollivate mehhanismide mõistmisel, on sõlmevahede tekkimise kohta suhteliselt vähe teada.
GA-de spatiotemporaalse jaotuse mõistmine aitab paremini mõista nende hormoonide funktsioone erinevates kudedes ja erinevatel arenguetappidel. RGA-GFP fusiooni lagunemise visualiseerimine, mida väljendatakse oma promootori toimel, annab olulist teavet GA kogutaseme reguleerimise kohta juurtes 15, 16. Kuid RGA ekspressioon varieerub kudedes17 ja seda reguleerib GA18. Seega võib RGA promootori diferentsiaalne ekspressioon põhjustada RGA-GFP puhul täheldatud fluorestsentsmustri ja seega ei ole see meetod kvantitatiivne. Hiljuti näitas bioaktiivne fluorestseiini (Fl) märgistatud GA19, 20 GA akumuleerumist juure endokorteksis ja selle rakutaseme reguleerimist GA transpordi abil. Hiljuti näitas GA FRET andur nlsGPS1, et GA tasemed korreleeruvad rakkude pikenemisega juurtes, filamentides ja tumedaks kasvanud hüpokotüülides21. Kuid nagu nägime, ei ole GA kontsentratsioon ainus parameeter, mis kontrollib GA signaaliülekande aktiivsust, kuna see sõltub keerulistest tuvastusprotsessidest. Tuginedes oma arusaamadele DELLA ja GA signaaliradade kohta, kirjeldame siin lagunemispõhise ratiomeetrilise biosensori väljatöötamist ja iseloomustamist GA signaalimiseks. Selle kvantitatiivse biosensori väljatöötamiseks kasutasime mutantset GA-tundlikku RGA-d, mis liideti fluorestseeruva valguga ja ekspresseeriti kõikjal kudedes, samuti GA-tundlikku fluorestseeruvat valku. Näitame, et mutantsed RGA-valgu fusioonid ei häiri endogeenset GA signaaliülekannet, kui need on kõikjal ekspresseeritud, ja et see biosensor suudab kvantifitseerida signaaliülekande aktiivsust, mis tuleneb nii GA sisendist kui ka GA signaali töötlemisest kõrge spatiotemporaalse eraldusvõimega sensorseadme poolt. Kasutasime seda biosensorit, et kaardistada GA signaaliülekande aktiivsuse spatiotemporaalne jaotus ja kvantifitseerida, kuidas GA reguleerib raku käitumist SAM-i epidermises. Näitame, et GA reguleerib elundi primordiate vahel asuvate SAM-rakkude jagunemistasandi orientatsiooni, määratledes seeläbi sõlmedevahelise kanoonilise rakulise organisatsiooni.
Lõpuks küsisime, kas qmRGA võib teatada endogeense GA taseme muutustest, kasutades kasvavaid hüpokotüüle. Varem näitasime, et nitraat stimuleerib kasvu, suurendades GA sünteesi ja omakorda DELLA34 lagunemist. Sellest lähtuvalt täheldasime, et hüpokotüüli pikkus pUBQ10 :: qmRGA seemikute puhul, mida kasvatati rikkaliku nitraadivarustuse all (10 mM NO3-), oli oluliselt pikem kui nitraadipuudulikes tingimustes kasvatatud seemikute puhul (täiendav joonis 6a). Kooskõlas kasvureaktsiooniga olid GA signaalid kõrgemad 10 mM NO3-tingimustes kasvatatud seemikute hüpokotüülides kui nitraadi puudumisel kasvatatud seemikute puhul (täiendav joonis 6b, c). Seega võimaldab qmRGA jälgida ka GA kontsentratsiooni endogeensetest muutustest põhjustatud muutusi GA signaaliülekandes.
Et mõista, kas qmRGA poolt tuvastatud GA signaaliülekande aktiivsus sõltub GA kontsentratsioonist ja GA tajumisest, nagu anduri disaini põhjal eeldati, analüüsisime kolme GID1 retseptori ekspressiooni vegetatiivsetes ja reproduktiivkudedes. Seemikute puhul näitas GID1-GUS reporterliin, et GID1a ja c olid idulehtedes tugevalt ekspresseeritud (joonis 3a–c). Lisaks ekspresseeriti kõiki kolme retseptorit lehtedes, külgmistes juureprimordiades, juureotstes (välja arvatud GID1b juuremüts) ja veresoonkonnas (joonis 3a–c). Õisiku SAM-is tuvastasime GUS-signaalid ainult GID1b ja 1c jaoks (täiendav joonis 7a–c). In situ hübridisatsioon kinnitas neid ekspressioonimustreid ja näitas veelgi, et GID1c ekspresseeriti ühtlaselt madalal tasemel SAM-is, samas kui GID1b ekspressioon oli kõrgem SAM-i perifeerias (täiendav joonis 7d–l). PGID1b::2xmTQ2-GID1b translatsiooniline liitmine näitas ka GID1b ekspressiooni astmelist vahemikku, alates madalast ekspressioonist või selle puudumisest SAM-i keskel kuni kõrge ekspressioonini elundi piiridel (täiendav joonis 7m). Seega ei ole GID1 retseptorid kudedes ega kudedes ühtlaselt jaotunud. Järgnevates katsetes täheldasime ka, et GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) üleekspressioon suurendas hüpokotüülide qmRGA tundlikkust välisele GA-rakendusele (joonis 3d, e). Seevastu hüpokotüülis qd17mRGA abil mõõdetud fluorestsents oli GA3-ravi suhtes tundlik (joonis 3f, g). Mõlema testi puhul töödeldi seemikuid kõrge kontsentratsiooniga GA-ga (100 μM GA3), et hinnata anduri kiiret käitumist, kus võime GID1 retseptoriga seonduda suurenes või kadus. Need tulemused kinnitavad koos, et qmRGA biosensor täidab kombineeritud funktsiooni GA ja GA andurina ning viitab sellele, et GID1 retseptori diferentsiaalne ekspressioon võib anduri kiirgusvõimet märkimisväärselt moduleerida.
Praeguseks on GA-signaalide jaotus SAM-is ebaselge. Seetõttu kasutasime GA signaaliülekande aktiivsuse kõrge eraldusvõimega kvantitatiivsete kaartide arvutamiseks qmRGA-d ekspresseerivaid taimi ja pCLV3::mCherry-NLS tüviraku reporterit35, keskendudes L1 kihile (epidermis; joonised 4a, b, vt Meetodid ja täiendavad meetodid), kuna L31 mängib kasvukontrollis võtmerolli. Siin andis pCLV3 :: mCherry-NLS ekspressioon fikseeritud geomeetrilise võrdluspunkti GA signaaliülekande aktiivsuse aegruumilise jaotuse analüüsimiseks37. Kuigi GA-d peetakse elundi külgmise arengu jaoks oluliseks4, täheldasime, et GA signaalid olid madalad õie primordiumis (P) alates P3 staadiumist (joonis 4a, b), samas kui noortel P1 ja P2 primordiumidel oli mõõdukas aktiivsus, mis sarnanes keskpiirkonna aktiivsusega (joonis 4a, b). Kõrgem GA signaaliülekande aktiivsus tuvastati elundi ürgsete piiridel, alustades P1/P2-st (piiri külgedelt) ja saavutades haripunkti P4-st, samuti kõigis primordiade vahel asuva perifeerse piirkonna rakkudes (joonis 4a, b ja täiendav joonis 8a, b). Seda kõrgemat GA signaaliülekande aktiivsust ei täheldatud mitte ainult epidermises, vaid ka L2 ja ülemistes L3 kihtides (täiendav joonis 8b). Ka qmRGA abil SAM-is tuvastatud GA-signaalide muster jäi aja jooksul muutumatuks (täiendav joonis 8c-f, k). Kuigi qd17mRGA konstruktsiooni T3 taimede SAM-is süstemaatiliselt alla reguleeriti viiest sõltumatust joonest, mida me üksikasjalikult iseloomustasime, saime analüüsida pRPS5a :: VENUS-2A-TagBFP konstruktiga saadud fluorestsentsmustreid (täiendav joonis 8g – j, l). Selles kontrolljoones tuvastati SAM-is ainult väikesed muutused fluorestsentssuhtes, kuid SAM-i keskuses täheldasime TagBFP-ga seotud VENUS-e selget ja ootamatut vähenemist. See kinnitab, et qmRGA poolt täheldatud signaalimismuster peegeldab mRGA-VENUSe GA-sõltuvat lagunemist, kuid näitab ka, et qmRGA võib GA signaaliülekande aktiivsust meristeemikeskuses üle hinnata. Kokkuvõttes näitavad meie tulemused GA signaalimismustrit, mis peegeldab peamiselt primordiate jaotust. See ürgsete piirkondade (IPR) jaotus on tingitud kõrge GA signaaliülekande aktiivsuse järkjärgulisest kujunemisest areneva ürgpiirkonna ja keskpiirkonna vahel, samal ajal kui GA signaaliülekande aktiivsus ürgses väheneb (joonis 4c, d).
GID1b ja GID1c retseptorite jaotus (vt ülal) viitab sellele, et GA retseptorite erinev ekspressioon aitab kujundada GA signaaliülekande aktiivsust SAM-is. Mõtlesime, kas see võib olla seotud GA diferentseeritud kogunemisega. Selle võimaluse uurimiseks kasutasime nlsGPS1 GA FRET andurit21. Suurenenud aktiveerimissagedus tuvastati nlsGPS1 SAM-is, mida töödeldi 10 μM GA4 + 7-ga 100 minutit (täiendav joonis 9a–e), mis näitab, et nlsGPS1 reageerib muutustele GA kontsentratsioonis SAM-is, nagu ka juurtes21. NlsGPS1 aktiveerimissageduse ruumiline jaotus näitas suhteliselt madalaid GA tasemeid SAM-i väliskihtides, kuid näitas, et need olid SAM-i keskel ja piiridel kõrgendatud (joonis 4e ja täiendav joonis 9a, c). See viitab sellele, et GA-d jaotatakse ka SAM-is ruumilise mustriga, mis on võrreldav qmRGA paljastatuga. Täiendava lähenemisviisina käsitlesime SAM-i negatiivse kontrollina ka ainult fluorestseeruva GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) või Fl-ga. Fl-signaal jaotati kogu SAM-is, kaasa arvatud keskpiirkond ja primordium, kuigi madalama intensiivsusega (joonis 4j ja täiendav joonis 10d). Seevastu kõik kolm GA-Fl kogunesid spetsiifiliselt primordiumi piiridesse ja erineval määral ülejäänud IPR-is, kusjuures GA7-Fl kogunes IPR-i suurimasse domeeni (joonis 4k ja täiendav joonis 10a, b). Fluorestsentsi intensiivsuse kvantifitseerimine näitas, et IPR ja mitte-IPR intensiivsuse suhe oli kõrgem GA-Fl-ga töödeldud SAM-is võrreldes Fl-ga töödeldud SAM-iga (joonis 4l ja täiendav joonis 10c). Need tulemused näitavad koos, et GA esineb kõrgemates kontsentratsioonides IPR-rakkudes, mis asuvad elundi piirile kõige lähemal. See viitab sellele, et SAM GA signaaliülekande aktiivsuse muster tuleneb nii GA retseptorite erinevast ekspressioonist kui ka GA erinevast akumuleerumisest IPR rakkudes elundipiiride lähedal. Seega näitas meie analüüs GA signaalimise ootamatut spatiotemporaalset mustrit, mille aktiivsus oli madalam SAM-i keskel ja primordiumis ning kõrgem aktiivsus IPR-is perifeerses piirkonnas.
Et mõista diferentsiaalse GA signaaliülekande rolli SAM-is, analüüsisime korrelatsiooni GA signaaliülekande aktiivsuse, rakkude laienemise ja rakkude jagunemise vahel, kasutades SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS-i reaalajas aeglustatud kujutist. Arvestades GA rolli kasvuregulatsioonis, eeldati positiivset korrelatsiooni raku laienemise parameetritega. Seetõttu võrdlesime esmalt GA signaaliülekande aktiivsuse kaarte rakupinna kasvukiiruse kaartidega (antud raku ja tütarrakkude laienemise tugevuse proksina) ja kasvu anisotroopia kaartidega, mis mõõdavad raku laienemise suunda (kasutatakse siin ka antud metoodika ja tütarrakkude jaoks jagunemisel; joonised 5a, b ja lisad). Meie SAM-i rakupinna kasvukiiruse kaardid on kooskõlas varasemate tähelepanekutega 38, 39, minimaalsete kasvumääradega piiril ja maksimaalsete kasvumääradega lillede arenemisel (joonis 5a). Põhikomponentide analüüs (PCA) näitas, et GA signaaliülekande aktiivsus oli negatiivses korrelatsioonis rakupinna kasvu intensiivsusega (joonis 5c). Samuti näitasime, et peamised variatsiooniteljed, sealhulgas GA signaalimise sisend ja kasvu intensiivsus, olid kõrge CLV3 ekspressiooniga määratud suuna suhtes ortogonaalsed, kinnitades rakkude väljajätmist SAM-keskusest ülejäänud analüüsides. Spearmani korrelatsioonianalüüs kinnitas PCA tulemusi (joonis 5d), mis näitab, et kõrgemad GA-signaalid IPR-is ei põhjustanud rakkude suuremat laienemist. Kuid korrelatsioonianalüüs näitas kerget positiivset korrelatsiooni GA signaaliülekande aktiivsuse ja kasvu anisotroopia vahel (joonis 5c, d), mis viitab sellele, et kõrgem GA signaaliülekanne IPR-is mõjutab rakkude kasvu suunda ja võib-olla ka raku jagunemise tasapinna asukohta.
a, b SAM-i keskmise pinnakasvu (a) ja kasvuanisotroopia (b) soojuskaardid keskmisena seitsme sõltumatu taime kohta (kasutatakse vastavalt rakkude laienemise tugevuse ja suuna proksidena). c PCA analüüs hõlmas järgmisi muutujaid: GA signaal, pinna kasvu intensiivsus, pinna kasvu anisotroopia ja CLV3 ekspressioon. PCA komponent 1 oli peamiselt negatiivses korrelatsioonis pinna kasvu intensiivsusega ja positiivses korrelatsioonis GA signaaliga. PCA komponent 2 oli peamiselt positiivses korrelatsioonis pinna kasvu anisotroopiaga ja negatiivses korrelatsioonis CLV3 ekspressiooniga. Protsendid näitavad iga komponendi poolt seletatud variatsiooni. d Spearmani korrelatsioonianalüüs GA signaali, pinna kasvu intensiivsuse ja pinna kasvu anisotroopia vahel koeskaalal, välja arvatud CZ. Parempoolne number on Spearmani rho väärtus kahe muutuja vahel. Tärnid näitavad juhtumeid, kus korrelatsioon/negatiivne korrelatsioon on väga oluline. e Col-0 SAM L1 rakkude 3D visualiseerimine konfokaalse mikroskoopia abil. 10 tunni pärast SAM-is (kuid mitte primordiumis) moodustunud uued rakuseinad värvitakse vastavalt nende nurga väärtustele. Värviriba on näidatud paremas alanurgas. Sisend näitab vastavat 3D-pilti kell 0 h. Katset korrati kaks korda sarnaste tulemustega. f Kastdiagrammid näitavad rakkude jagunemise kiirust IPR-is ja mitte-IPR Col-0 SAM-is (n = 10 sõltumatut tehast). Keskjoon näitab mediaani ja kasti piirid näitavad 25. ja 75. protsentiili. Vunrud näitavad R-tarkvaraga määratud minimaalseid ja maksimaalseid väärtusi. P väärtused saadi Welchi kahepoolse t-testiga. g, h Skemaatiline diagramm, mis näitab (g) kuidas mõõta uue rakuseina (magenta) nurka radiaalsuuna suhtes SAM-i keskpunktist (valge punktiirjoon) (arvestatakse ainult teravnurga väärtusi, st 0–90°), ja (h) meristeemi ümbermõõt/külgmised ja radiaalsuunad. i Rakkude jagunemise tasapinna orientatsiooni sagedushistogrammid vastavalt SAM-i (tumesinine), IPR-i (kesksinine) ja mitte-IPR-i (helesinine) vahel. P väärtused saadi kahepoolse Kolmogorovi-Smirnovi testiga. Katset korrati kaks korda sarnaste tulemustega. j IPR raku jagunemise tasapinna orientatsiooni sagedushistogrammid vastavalt P3 (heleroheline), P4 (keskmine roheline) ja P5 (tumeroheline) ümber. P väärtused saadi kahepoolse Kolmogorovi-Smirnovi testiga. Katset korrati kaks korda sarnaste tulemustega.
Seetõttu uurisime järgmisena korrelatsiooni GA signaaliülekande ja raku jagunemise aktiivsuse vahel, tuvastades testi ajal äsja moodustunud rakuseinad (joonis 5e). See lähenemisviis võimaldas meil mõõta rakkude jagunemise sagedust ja suunda. Üllatuslikult avastasime, et rakkude jagunemise sagedus IPR-is ja ülejäänud SAM-is (mitte-IPR, joonis 5f) oli sarnane, mis näitab, et erinevused GA signaaliülekandes IPR-i ja mitte-IPR-rakkude vahel ei mõjuta oluliselt rakkude jagunemist. See ning positiivne korrelatsioon GA signaaliülekande ja kasvu anisotroopia vahel ajendasid meid mõtlema, kas GA signaaliülekande aktiivsus võib mõjutada raku jagunemise tasapinna orientatsiooni. Mõõtsime uue rakuseina orientatsiooni teravnurgana meristeemi keskpunkti ja uue rakuseina keskpunkti ühendava radiaaltelje suhtes (joonis 5e-i) ning täheldasime selget tendentsi, et rakud jagunevad radiaaltelje suhtes 90° lähedase nurga all, kõrgeimad sagedused on täheldatud 70–80° ja 230 2–6% (230,2–6%). (joonis 5e, i), mis vastab rakkude jagunemisele ring-/ristisuunas (joonis 5h). Et uurida GA signaalimise panust sellesse raku jagunemiskäitumisse, analüüsisime raku jagunemise parameetreid IPR-is ja mitte-IPR-is eraldi (joonis 5i). Me täheldasime, et jagunemisnurga jaotus IPR-rakkudes erines mitte-IPR-rakkude ja kogu SAM-i rakkude omast, kusjuures IPR-rakkudel oli suurem külgmiste / ringikujuliste rakkude jagunemise osakaal, st 70–80 ° ja 80–90 ° (vastavalt 33,86% ja 30,71%, vastavad proportsioonid) (joonis 1). Seega näitasid meie tähelepanekud seost kõrge GA signaaliülekande ja rakkude jagunemise tasapinna orientatsiooni vahel, mis on lähedal ümbermõõdu suunas, sarnaselt GA signaaliülekande aktiivsuse ja kasvu anisotroopia vahelisele korrelatsioonile (joonis 5c, d). Selle ühenduse ruumilise säilimise edasiseks kindlakstegemiseks mõõtsime primordiumi ümbritsevates IPR-rakkudes jagunemistasandi orientatsiooni alates P3-st, kuna selles piirkonnas tuvastati kõrgeim GA signaaliülekande aktiivsus alates P4-st (joonis 4). IPR jagunemisnurgad P3 ja P4 ümber ei näidanud statistiliselt olulisi erinevusi, kuigi külgmiste rakkude jagunemise sagedust täheldati IPR-s P4 ümber (joonis 5j). Kuid P5 ümber olevates IPR-rakkudes muutus rakkude jagunemise tasapinna orientatsiooni erinevus statistiliselt oluliseks, kusjuures põikisuunaliste rakkude jagunemise sagedus suurenes järsult (joonis 5j). Need tulemused näitavad koos, et GA signaalimine võib kontrollida rakkude jagunemise orientatsiooni SAM-is, mis on kooskõlas varasemate aruannetega 40, 41, et kõrge GA signaalimine võib indutseerida rakkude jagunemise külgsuunas IPR-is.
Ennustatakse, et intellektuaalomandi õigustes olevad rakud ei liideta primordiasse, vaid pigem sõlmevahedesse 2, 42, 43. Rakkude jagunemise põikisuunaline orientatsioon IPR-is võib põhjustada epidermise rakkude paralleelsete pikisuunaliste ridade tüüpilise korralduse internodes. Meie ülalkirjeldatud tähelepanekud viitavad sellele, et GA signaalimine mängib selles protsessis tõenäoliselt rolli, reguleerides rakkude jagunemise suunda.
Mitme DELLA geeni funktsiooni kadumine põhjustab konstitutiivse GA vastuse ja selle hüpoteesi testimiseks saab kasutada della mutante44. Esmalt analüüsisime viie DELLA geeni ekspressioonimustreid SAM-is. GUS-liini45 transkriptsiooniline liitmine näitas, et GAI, RGA, RGL1 ja RGL2 (palju vähemal määral) ekspresseerusid SAM-is (täiendav joonis 11a–d). In situ hübridisatsioon näitas veel, et GAI mRNA akumuleerub spetsiifiliselt ürgstes ja arenevates lilledes (täiendav joonis 11e). RGL1 ja RGL3 mRNA tuvastati kogu SAM-i võrastiku ulatuses ja vanemates lilledes, samas kui RGL2 mRNA-d oli piiripiirkonnas rikkalikum (täiendav joonis 11f – h). pRGL3::RGL3-GFP SAM-i konfokaalne kujutis kinnitas in situ hübridisatsiooniga täheldatud ekspressiooni ja näitas, et RGL3 valk akumuleerub SAM-i keskosas (täiendav joonis 11i). Kasutades pRGA::GFP-RGA liini, leidsime ka, et RGA valk koguneb SAM-i, kuid selle arvukus väheneb piiril alates P4-st (täiendav joonis 11j). Eelkõige on RGL3 ja RGA ekspressioonimustrid kooskõlas kõrgema GA signaaliülekande aktiivsusega IPR-is, nagu tuvastas qmRGA (joonis 4). Veelgi enam, need andmed näitavad, et kõik DELLA-d on väljendatud SAM-is ja nende väljendus hõlmab kogu SAM-i.
Järgmisena analüüsisime raku jagunemise parameetreid metsiktüüpi SAM-is (Ler, kontroll) ja gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (globaalne) mutantides (joonis 6a, b). Huvitaval kombel täheldasime della globaalse mutantse SAM-i raku jagunemisnurga sageduste jaotuses statistiliselt olulist nihet metsiktüübiga võrreldes (joonis 6c). See muutus della globaalses mutandis oli tingitud 80–90° nurkade (34,71% vs. 24,55%) ja vähemal määral 70–80° nurkade (23,78% vs 20,18%) sageduse suurenemisest, st mis vastab rakkude põiki jagunemisele (joonis 6c). Mitteristi jagunemise sagedus (0–60°) oli samuti madalam della globaalses mutandis (joonis 6c). Rakkude põikjagunemise sagedus suurenes della globaalse mutandi SAM-is oluliselt (joonis 6b). Rakkude põiki jagunemise sagedus IPR-is oli samuti kõrgem della globaalses mutandis võrreldes metsiktüübiga (joonis 6d). Väljaspool IPR piirkonda oli metsiktüübil rakkude jagunemisnurkade jaotus ühtlasem, samas kui della globaalne mutant eelistas tangentsiaalset jagunemist nagu IPR (joonis 6e). Kvantifitseerisime ka rakkude jagunemise orientatsiooni ga2 oksüdaasi (ga2ox) viiekordsete mutantide (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 ja ga2ox6-2), GA-inaktiivse mutandi taustal, milles GA akumuleerub, SAM-is. Kooskõlas GA taseme tõusuga oli viiekordse ga2ox mutantse õisiku SAM suurem kui Col-0 oma (täiendav joonis 12a, b) ja võrreldes Col-0-ga näitas viiekordne ga2ox SAM raku jagunemisnurkade jaotumist selgelt erinevalt, kusjuures nurga sagedus kasvas 50°-lt, st 9ings00°-lt, st taas 9ings00°. (Täiendavad joonised 12a–c). Seega näitame, et GA signaaliülekande ja GA akumulatsiooni konstitutiivne aktiveerimine indutseerivad külgmisi rakkude jagunemist IPR-is ja ülejäänud SAM-is.
a, b PI-värvitud Ler (a) ja globaalse della mutandi (b) SAM L1 kihi 3D visualiseerimine konfokaalse mikroskoopia abil. 10-tunnise perioodi jooksul SAM-is (kuid mitte primordiumis) moodustunud uued rakuseinad on näidatud ja värvitud vastavalt nende nurga väärtustele. Sisend näitab SAM-i kell 0 h. Värviriba kuvatakse paremas alanurgas. Nool punktis b osutab globaalses della mutandis joondatud rakufailide näitele. Katset korrati kaks korda sarnaste tulemustega. ce raku jagunemise tasapinna orientatsioonide sagedusjaotuse võrdlus kogu SAM-is (d), IPR-is (e) ja mitte-IPR-is (f) Leri ja globaalse della vahel. P väärtused saadi kahepoolse Kolmogorovi-Smirnovi testi abil. f, g Col-0 (i) ja pCUC2::gai-1-VENUS (j) transgeensete taimede PI-värvitud SAM-i konfokaalsete kujutiste 3D-visualiseerimine. Paneelid (a, b) näitavad SAM-is 10 tunni jooksul moodustunud uusi rakuseinu (kuid mitte primordiaid). Katset korrati kaks korda sarnaste tulemustega. h–j Kogu SAM-is (h), IPR-is (i) ja mitte-IPR-is (j) paiknevate rakkude jagunemise tasapinna orientatsioonide sagedusjaotuse võrdlus Col-0 ja pCUC2::gai-1-VENUS taimede vahel. P väärtused saadi kahepoolse Kolmogorovi-Smirnovi testi abil.
Järgmisena testisime GA signaalimise pärssimise mõju konkreetselt IPR-is. Sel eesmärgil kasutasime VENUS-ega liidetud domineeriva negatiivse gai-1 valgu ekspressiooni juhtimiseks idulehtede tassi 2 (CUC2) promootorit (liinis pCUC2::gai-1-VENUS). Metsiktüüpi SAM-is juhib CUC2 promootor enamiku IPR-de ekspressiooni SAM-is, sealhulgas piirirakkudes, alates P4-st ja sarnast spetsiifilist ekspressiooni täheldati ka pCUC2::gai-1-VENUS taimedes (vt allpool). Rakkude jagunemisnurkade jaotus pCUC2::gai-1-VENUS taimede SAM-i või IPR-i vahel ei erinenud oluliselt metsiktüübi omast, kuigi ootamatult avastasime, et ilma IPR-ita rakud jagunesid nendes taimedes suurema sagedusega 80–90° (joonis 6f–j).
On oletatud, et rakkude jagunemise suund sõltub SAM-i geomeetriast, eriti koe kõverusest põhjustatud tõmbepingest . Seetõttu küsisime, kas SAM-i kuju muudeti della globaalses mutandis ja pCUC2 :: gai-1-VENUS taimedes. Nagu varem teatatud12, oli della globaalse mutandi SAM-i suurus suurem kui metsiktüübil (täiendav joonis 13a, b, d). CLV3 ja STM RNA in situ hübridisatsioon kinnitas meristeemi laienemist della mutantides ja näitas lisaks tüvirakkude niši külgsuunalist laienemist (täiendav joonis 13e, f, h, i). Kuid SAM-i kõverus oli mõlemas genotüübis sarnane (täiendav joonis 13k, m, n, p). Me täheldasime gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della neljakordse mutandi suuruse sarnast suurenemist ilma kumeruse muutumiseta võrreldes metsiktüübiga (täiendav joonis 13c, d, g, j, l, o, p). Rakkude jagunemise orientatsiooni sagedust mõjutas ka della neljakordne mutand, kuid vähemal määral kui della monoliitmutandis (täiendav joonis 12d – f). See annustamisefekt koos mõju puudumisega kõverusele viitab sellele, et Della neljakordse mutandi RGL3 jääkaktiivsus piirab DELLA aktiivsuse kadumisest põhjustatud muutusi raku jagunemise orientatsioonis ja et muutused rakkude külgmistes jagunemistes toimuvad pigem vastusena muutustele GA signaaliülekande aktiivsuses, mitte SAM-i geomeetria muutustele. Nagu ülalpool kirjeldatud, juhib CUC2 promootor IPR ekspressiooni SAM-is alates P4-st (täiendav joonis 14a, b) ja vastupidi, pCUC2::gai-1-VENUS SAM-il oli väiksem suurus, kuid suurem kumerus (täiendav joonis 14c–h). See pCUC2::gai-1-VENUS SAM-i morfoloogia muutus võib põhjustada mehaaniliste pingete erineva jaotuse võrreldes metsiktüübiga, mille korral suured ümbermõõdu pinged algavad SAM-i keskpunktist lühemal kaugusel47. Teise võimalusena võivad muutused pCUC2::gai-1-VENUS SAM-i morfoloogias tuleneda transgeeni ekspressioonist põhjustatud piirkondlike mehaaniliste omaduste muutustest48. Mõlemal juhul võib see osaliselt kompenseerida GA signaalimise muutuste mõju, suurendades tõenäosust, et rakud jagunevad ümbermõõdu/ristisuunas, selgitades meie tähelepanekuid.
Kokkuvõttes kinnitavad meie andmed, et kõrgem GA signaalimine mängib aktiivset rolli raku jagunemise tasapinna külgsuunas IP-s. Samuti näitavad need, et meristeemi kõverus mõjutab ka raku jagunemise tasapinna orientatsiooni IPR-is.
Jaotustasandi ristsuunaline orientatsioon IPR-is kõrge GA signaaliülekande aktiivsuse tõttu viitab sellele, et GA eelorganiseerib SAM-is epidermis radiaalse rakufaili, et määratleda rakuline struktuur, mis hiljem leitakse epidermise sõlmedevahelises sõlmes. Tõepoolest, sellised rakufailid olid sageli nähtavad della globaalsete mutantide SAM-piltidel (joonis 6b). Seega kasutasime SAM-is GA signaalimise ruumilise mustri arengufunktsiooni edasiseks uurimiseks aeglustatud kujutist, et analüüsida rakkude ruumilist korraldust IPR-is metsiktüüpi (Ler ja Col-0), della globaalsete mutantide ja pCUC2::gai-1-VENUS transgeensete taimede puhul.
Leidsime, et qmRGA näitas, et GA signaaliülekande aktiivsus IPR-is suurenes P1/P2-st ja saavutas haripunkti P4 juures ning see muster jäi aja jooksul muutumatuks (joonis 4a–f ja täiendav joonis 8c–f, k). Rakkude ruumilise korralduse analüüsimiseks IPR-is suureneva GA signaaliga märgistasime Ler IPR-rakud P4 kohal ja külgedel vastavalt nende arengusaatele, mida analüüsiti 34 tundi pärast esimest vaatlust, st rohkem kui kaks plastiidi korda, võimaldades meil jälgida IPR-rakke primordiumi arengu ajal P1 / P2-st P4-ni. Kasutasime kolme erinevat värvi: kollast nende rakkude jaoks, mis integreeriti ürgsesse P4 lähedale, rohelist nende rakkude jaoks, mis olid IPR-is, ja lillat nende rakkude jaoks, mis osalesid mõlemas protsessis (joonis 7a–c). Kell t0 (0 h) oli P4 ees näha 1–2 kihti IPR-rakke (joonis 7a). Ootuspäraselt tegid need rakud jagunemisel seda peamiselt ristijaotustasandi kaudu (joonised 7a–c). Sarnased tulemused saadi kasutades Col-0 SAM-i (keskendudes P3-le, mille äärised voldid sarnaselt P4-le Ler-is), kuigi selle genotüübi puhul peitis lillepiiril tekkinud volt IPR-rakud kiiremini (joonis 7g-i). Seega eelorganiseerib IPR-rakkude jagunemismuster rakud radiaalseteks ridadeks, nagu internodedes. Radiaalsete ridade korraldus ja IPR-rakkude lokaliseerimine järjestikuste elundite vahel viitab sellele, et need rakud on sõlmedevahelised eellasrakud.
Siin töötasime välja ratiomeetrilise GA signaalimise biosensori qmRGA, mis võimaldab GA ja GA retseptori kombineeritud kontsentratsioonist tuleneva GA signaaliülekande kvantitatiivset kaardistamist, minimeerides samal ajal endogeensete signaaliradade häireid, pakkudes seeläbi teavet GA funktsiooni kohta raku tasandil. Sel eesmärgil konstrueerisime modifitseeritud DELLA valgu mRGA, mis on kaotanud võime siduda DELLA interaktsioonipartnereid, kuid on endiselt tundlik GA-indutseeritud proteolüüsi suhtes. qmRGA reageerib nii eksogeensetele kui ka endogeensetele muutustele GA tasemetes ja selle dünaamilised sensoorsed omadused võimaldavad hinnata GA signaaliülekande aktiivsuse spatiotemporaalseid muutusi arengu ajal. qmRGA on ka väga paindlik tööriist, kuna seda saab kohandada erinevate kudedega, muutes selle ekspressiooniks kasutatavat promootorit (vajadusel) ning arvestades GA signaaliraja konservatiivset olemust ja PFYRE motiivi katteseemnetaimede vahel, on see tõenäoliselt ülekantav teistele liikidele22. Kooskõlas sellega näidati, et samaväärne mutatsioon riisi SLR1 DELLA valgus (HYY497AAA) pärsib SLR1 kasvu repressori aktiivsust, vähendades samal ajal vaid veidi selle GA-vahendatud lagunemist, sarnaselt mRGA23-ga. Eelkõige näitasid hiljutised Arabidopsise uuringud, et üks aminohappe mutatsioon PFYRE domeenis (S474L) muutis RGA transkriptsioonilist aktiivsust, ilma et see mõjutaks selle võimet suhelda transkriptsioonifaktori partneritega50. Kuigi see mutatsioon on väga lähedane mRGA-s esinevale kolmele aminohappe asendusele, näitavad meie uuringud, et need kaks mutatsiooni muudavad DELLA erinevaid omadusi. Kuigi enamik transkriptsioonifaktori partnereid seondub DELLA26,51 LHR1 ja SAW domeenidega, võivad mõned PFYRE domeeni konserveerunud aminohapped aidata neid interaktsioone stabiliseerida.
Sõlmedevaheline areng on taimede arhitektuuri ja saagikuse parandamise põhijoon. qmRGA näitas kõrgemat GA signaaliülekande aktiivsust IPR sõlmedevahelistes eellasrakkudes. Kombineerides kvantitatiivset pildistamist ja geneetikat, näitasime, et GA signalisatsioonimustrid kattuvad SAM-i epidermis ringikujuliste / põiksuunaliste rakkude jagunemise tasapindadega, kujundades sõlmedevaheliseks arenguks vajaliku raku jagunemise organisatsiooni. Arengu käigus on tuvastatud mitu raku jagunemise tasapinna orientatsiooni regulaatorit52,53. Meie töö on selge näide sellest, kuidas GA signaalimisaktiivsus seda raku parameetrit reguleerib. DELLA võib interakteeruda kokkupandavate valgukompleksidega41, nii et GA signaalimine võib reguleerida raku jagunemise tasapinna orientatsiooni, mõjutades otseselt kortikaalsete mikrotuubulite orientatsiooni40, 41, 54, 55. Näitasime ootamatult, et SAM-is ei olnud kõrgema GA signaaliülekande aktiivsuse korrelatsioon rakkude pikenemine ega jagunemine, vaid ainult kasvu anisotroopia, mis on kooskõlas GA otsese mõjuga rakkude jagunemise suunale IPR-is. Siiski ei saa välistada, et see mõju võib olla ka kaudne, näiteks vahendatud GA-indutseeritud rakuseina pehmenemise kaudu56. Muutused rakuseina omadustes põhjustavad mehaanilist pinget 57, 58, mis võib samuti mõjutada raku jagunemise tasapinna orientatsiooni, mõjutades kortikaalsete mikrotuubulite orientatsiooni 39, 46, 59. GA-indutseeritud mehaanilise pinge ja mikrotuubulite orientatsiooni otsese reguleerimise kombineeritud mõju GA-ga võib olla seotud spetsiifilise raku jagunemise orientatsiooni mustri loomisega IPR-is, et määratleda internodes, ja selle idee testimiseks on vaja täiendavaid uuringuid. Samamoodi on varasemad uuringud rõhutanud DELLA-ga interakteeruvate valkude TCP14 ja 15 tähtsust sõlmedevahelise moodustumise kontrollimisel 60, 61 ning need tegurid võivad vahendada GA toimet koos BREVIPEDICELLUS (BP) ja PENNYWISE (PNY), mis reguleerivad sõlmedevahelist arengut ja on näidanud, et need mõjutavad GA signaaliülekannet2, 62. Arvestades, et DELLA-d interakteeruvad brassinosteroidi, etüleeni, jasmoonhappe ja abstsitsiinhappe (ABA) signaaliradadega 63, 64 ja et need hormoonid võivad mõjutada mikrotuubulite orientatsiooni65, võivad GA mõju raku jagunemise orientatsioonile vahendada ka teised hormoonid.
Varased tsütoloogilised uuringud näitasid, et sõlmedevaheliseks arenguks on vaja nii Arabidopsis SAM-i sise- kui ka välimisi piirkondi 2, 42. Asjaolu, et GA reguleerib aktiivselt rakkude jagunemist sisekudedes12, toetab GA kahekordset funktsiooni meristeemi ja sõlmedevahelise suuruse reguleerimisel SAM-is. Suunatud rakkude jagunemise muster on tihedalt reguleeritud ka SAM-i sisemises koes ja see regulatsioon on varre kasvu jaoks oluline52. Huvitav on uurida, kas GA mängib rolli ka raku jagunemise tasapinna orienteerimisel SAM-i sisemises organisatsioonis, sünkroniseerides seeläbi SAM-i sisemiste sõlmede spetsifikatsiooni ja arengu.
Taimi kasvatati in vitro pinnases või 1x Murashige-Skoogi (MS) söötmes (Duchefa), millele oli lisatud 1% sahharoosi ja 1% agarit (Sigma), standardtingimustes (16 h valgus, 22 °C), välja arvatud hüpokotüüli ja juurekasvu katsed, kus seemikuid kasvatati vertikaalsetel plaatidel konstantse valguse ja 22 °C juures. Nitraadikatseteks kasvatati taimi pikapäevatingimustes modifitseeritud MS söötmel (bioWORLD taimesööde), millele oli lisatud piisavat nitraadi (0 või 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-suktsinaati, 1% sahharoosi ja 1% A-agarit (Sigma).
PDONR221-sse sisestatud GID1a cDNA rekombineeriti pDONR P4-P1R-pUBQ10 ja pDONR P2R-P3-mCherryga pB7m34GW-ks, et genereerida pUBQ10::GID1a-mCherry. PDONR221-sse sisestatud IDD2 DNA rekombineeriti pB7RWG266-sse, et saada p35S:IDD2-RFP. pGID1b::2xmTQ2-GID1b genereerimiseks amplifitseeriti esmalt 3,9 kb fragment GID1b kodeerivast piirkonnast ülesvoolu ja 4,7 kb fragment, mis sisaldas GID1b cDNA-d (1,3 kb) ja terminaatorit (3,4 kb), kasutades täiendavas tabelis 3 olevaid praimereid ning seejärel sisestati SDONRTher P1-P1R-i ja Fishermo4. pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) ja lõpuks rekombineeriti pDONR221 2xmTQ268-ga sihtvektoriks pGreen 012567, kasutades Gateway kloonimist. pCUC2::LSSmOrange genereerimiseks koondati CUC2 promootorjärjestus (3229 aluspaari ATG-st ülesvoolu), millele järgnes suure Stokesi nihkega mOrange'i (LSSmOrange)69 kodeeriv järjestus koos N7 tuuma lokaliseerimissignaali ja NOS-i transkriptsiooniterminaatoriga, kasutades pGreen kanamütsiini sihtimissüsteemi rekombinatsioonivektorit3 kasutades (Invitrogen). Taimne binaarne vektor viidi Agrobacterium tumefaciens tüvesse GV3101 ja viidi Nicotiana benthamiana lehtedesse vastavalt Agrobacterium infiltratsioonimeetodil ja Arabidopsis thaliana Col-0 lillede kastmismeetodil. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry ja pCLV3::mCherry-NLS qmRGA eraldati vastavalt vastavate ristamise F3 ja F1 järglastest.
RNA in situ hübridisatsioon viidi läbi umbes 1 cm pikkustel võrsete otstel72, mis koguti ja fikseeriti kohe FAA lahuses (3,7% formaldehüüd, 5% äädikhape, 50% etanool), mis oli eeljahutatud temperatuurini 4 °C. Pärast 2 × 15-minutilist vaakumtöötlust vahetati fiksaator ja proove inkubeeriti üleöö. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 ja RGL3 cDNA-d ja nende 3'-UTR-ide antisenss-sondid sünteesiti, kasutades täiendavas tabelis 3 näidatud praimereid, nagu on kirjeldanud Rosier et al.73. Digoksigeniiniga märgistatud sondid immunodetekteeriti, kasutades digoksigeniini antikehi (3000-kordne lahjendus; Roche, katalooginumber: 11 093 274 910) ja lõigud värviti 5-bromo-4-kloro-3-indolüülfosfaadiga (BCIP/-kordne dilulium-25) (NBT, 200-kordne lahjendus) lahus.
Postitusaeg: 10.02.2025