Võrse tipmise meristeemina (SAM) kasv on varre arhitektuuri seisukohalt kriitilise tähtsusega. Taimehormoonidgiberelliinid(GA-d) mängivad taimede kasvu koordineerimisel võtmerolli, kuid nende roll SAM-is on siiani halvasti mõistetav. Selles uuringus arendasime GA signaaliülekande ratiomeetrilise biosensori, konstrueerides DELLA valku, et pärssida selle olulist regulatiivset funktsiooni GA transkriptsioonivastuses, säilitades samal ajal selle lagunemise GA äratundmisel. Me näitame, et see lagunemisel põhinev biosensor registreerib täpselt GA taseme muutusi ja rakulist tajumist arengu ajal. Kasutasime seda biosensorit GA signaaliülekande aktiivsuse kaardistamiseks SAM-is. Me näitame, et kõrged GA signaalid esinevad peamiselt rakkudes, mis asuvad organite algete vahel, mis on internoodirakkude eelkäijad. Kasutades funktsiooni võimenduse ja kadumise meetodeid, näitame lisaks, et GA reguleerib rakkude jagunemistasandi orientatsiooni, luues internoodide kanoonilise rakulise organisatsiooni, soodustades seeläbi internoodide spetsifikatsiooni SAM-is.
Võrse tipmine meristeem (SAM), mis asub võrse tipus, sisaldab tüvirakkude nišši, mille aktiivsus genereerib külgorganeid ja varre sõlmi modulaarsel ja iteratiivsel viisil kogu taime eluea jooksul. Kõik need korduvad üksused ehk taimesõlmed hõlmavad sõlmedes asuvaid internode ja külgorganeid ning lehtede kaenlaalustes asuvaid aksillaarmeristeeme1. Taimesõlmede kasv ja organisatsioon muutub arengu käigus. Arabidopsis'el on internodaalne kasv vegetatiivses staadiumis pärsitud ja aksillaarmeristeemid jäävad roseti lehtede kaenlaalustes uinunud olekusse. Õitsemisfaasi üleminekul muutub SAM õisiku meristeemiks, genereerides piklikke internode ja kaenlaaluseid pungi, oksakesi varre lehtede kaenlaalustes ja hiljem lehtedeta õisi2. Kuigi oleme teinud märkimisväärseid edusamme lehtede, õite ja okste teket kontrollivate mehhanismide mõistmisel, on internodede tekkimise kohta suhteliselt vähe teada.
GA-de ajalis-ruumilise jaotuse mõistmine aitab paremini mõista nende hormoonide funktsioone erinevates kudedes ja erinevates arenguetappides. RGA-GFP fusiooni lagunemise visualiseerimine oma promootori toimel annab olulist teavet GA koguhulga regulatsiooni kohta juurtes15,16. RGA ekspressioon on aga kudedes erinev17 ja seda reguleerib GA18. Seega võib RGA promootori diferentsiaalne ekspressioon anda tulemuseks RGA-GFP puhul täheldatud fluorestsentsmustri ja seega ei ole see meetod kvantitatiivne. Hiljuti näitas bioaktiivne fluorestseiiniga (Fl) märgistatud GA19,20 GA akumuleerumist juure endokorteksis ja selle rakulise taseme reguleerimist GA transpordi abil. Hiljuti näitas GA FRET andur nlsGPS1, et GA tasemed korreleeruvad rakkude pikenemisega juurtes, filamentides ja tumedalt kasvanud hüpokotüülides21. Nagu me aga nägime, ei ole GA kontsentratsioon ainus GA signaaliülekande aktiivsust kontrolliv parameeter, kuna see sõltub keerukatest sensoorsetest protsessidest. Tuginedes meie arusaamale DELLA ja GA signaaliülekande radadest, esitame käesolevas töös GA signaaliülekande jaoks mõeldud degradatsioonipõhise ratiomeetrilise biosensori väljatöötamise ja iseloomustamise. Selle kvantitatiivse biosensori väljatöötamiseks kasutasime mutantset GA-tundlikku RGA-d, mis oli liidetud fluorestseeruva valguga ja ekspresseeritud kõikjal kudedes, samuti GA-tundetut fluorestseeruvat valku. Näitame, et mutantse RGA valgu fusioonid ei häiri endogeenset GA signaaliülekannet, kui neid kõikjal ekspresseeritakse, ja et see biosensor suudab kvantifitseerida nii GA sisendist kui ka GA signaali töötlemisest tulenevat signaaliaktiivsust anduriseadme poolt kõrge aegruumilise lahutusvõimega. Kasutasime seda biosensorit GA signaaliülekande aktiivsuse aegruumilise jaotuse kaardistamiseks ja selle kvantifitseerimiseks, kuidas GA reguleerib rakkude käitumist SAM-epidermis. Näitame, et GA reguleerib elundi algete vahel paiknevate SAM-rakkude jagunemistasandi orientatsiooni, määratledes seeläbi internoodi kanoonilise rakulise organisatsiooni.
Lõpuks küsisime, kas qmRGA suudab kasvavate hüpokotüülide abil jälgida endogeense GA taseme muutusi. Varem näitasime, et nitraat stimuleerib kasvu, suurendades GA sünteesi ja seega DELLA34 lagunemist. Sellest tulenevalt täheldasime, et rohke nitraadivarustuse (10 mM NO3−) tingimustes kasvatatud pUBQ10::qmRGA seemikute hüpokotüüli pikkus oli oluliselt pikem kui nitraadivaestes tingimustes kasvatatud seemikutel (lisajoonis 6a). Kooskõlas kasvureaktsiooniga olid GA signaalid 10 mM NO3− tingimustes kasvatatud seemikute hüpokotüülides kõrgemad kui nitraadita kasvatatud seemikutel (lisajoonis 6b, c). Seega võimaldab qmRGA jälgida ka GA signaaliülekande muutusi, mis on indutseeritud GA kontsentratsiooni endogeensete muutuste poolt.
Et mõista, kas qmRGA poolt tuvastatud GA signaaliülekande aktiivsus sõltub GA kontsentratsioonist ja GA tajumisest, nagu sensori disaini põhjal oodata võis, analüüsisime kolme GID1 retseptori ekspressiooni vegetatiivsetes ja reproduktiivkoes. Seemikutes näitas GID1-GUS reporterliin, et GID1a ja c ekspresseerusid idulehtedes kõrgelt (joonis 3a–c). Lisaks ekspresseerusid kõik kolm retseptorit lehtedes, külgmistes juurevõsudes, juuretipudes (välja arvatud GID1b juurekate) ja veresoonte süsteemis (joonis 3a–c). Õisiku SAM-is tuvastasime GUS signaale ainult GID1b ja 1c puhul (lisajoonis 7a–c). In situ hübridisatsioon kinnitas neid ekspressioonimustreid ja näitas lisaks, et GID1c ekspresseerus SAM-is ühtlaselt madalal tasemel, samas kui GID1b näitas kõrgemat ekspressiooni SAM-i perifeerias (lisajoonis 7d–l). pGID1b::2xmTQ2-GID1b translatsiooniline fusioon näitas ka GID1b ekspressiooni astmelist vahemikku, alates madalast või olematust ekspressioonist SAM-i keskel kuni kõrge ekspressioonini elundi piiridel (lisajoonis 7m). Seega ei ole GID1 retseptorid kudedes ja kudedes ühtlaselt jaotunud. Järgnevates katsetes täheldasime ka, et GID1 üleekspressioon (pUBQ10::GID1a-mCherry) suurendas qmRGA tundlikkust hüpokotüülides välise GA-rakenduse suhtes (joonis 3d, e). Seevastu qd17mRGA abil hüpokotüülis mõõdetud fluorestsents oli GA3-töötluse suhtes tundetu (joonis 3f, g). Mõlema analüüsi puhul töödeldi seemikuid GA kõrge kontsentratsiooniga (100 μM GA3), et hinnata anduri kiiret käitumist, kus GID1 retseptoriga seondumise võime oli suurenenud või kadunud. Need tulemused kinnitavad kokkuvõttes, et qmRGA biosensoril on kombineeritud GA ja GA anduri funktsioon ning need viitavad sellele, et GID1 retseptori diferentsiaalne ekspressioon võib anduri kiirgusvõimet oluliselt moduleerida.
Praeguseks on GA signaalide jaotus SAM-is ebaselge. Seetõttu kasutasime qmRGA-d ekspresseerivaid taimi ja pCLV3::mCherry-NLS tüvirakkude reporterit35, et arvutada GA signaaliülekande aktiivsuse kõrge eraldusvõimega kvantitatiivseid kaarte, keskendudes L1 kihile (epidermis; joonis 4a, b, vt meetodid ja täiendavad meetodid), kuna L1 mängib SAM-i kasvu kontrollimisel võtmerolli36. Siin andis pCLV3::mCherry-NLS ekspressioon fikseeritud geomeetrilise võrdluspunkti GA signaaliülekande aktiivsuse aegruumilise jaotuse analüüsimiseks37. Kuigi GA-d peetakse külgmiste organite arengu jaoks oluliseks4, täheldasime, et GA signaalid olid õie algetapis (P) alates P3 staadiumist madalad (joonis 4a, b), samas kui noortel P1 ja P2 algetappidel oli mõõdukas aktiivsus, mis sarnanes keskpiirkonna aktiivsusega (joonis 4a, b). Kõrgemat GA signaaliülekande aktiivsust tuvastati elundi algebra piiridel, alustades P1/P2-st (piiri külgedelt) ja saavutades haripunkti P4-l, samuti kõigis perifeerse piirkonna rakkudes, mis paiknesid algete vahel (joonis 4a, b ja lisajoonis 8a, b). Seda kõrgemat GA signaaliülekande aktiivsust täheldati mitte ainult epidermises, vaid ka L2 ja ülemistes L3 kihtides (lisajoonis 8b). qmRGA abil SAM-is tuvastatud GA signaalide muster jäi aja jooksul samuti muutumatuks (lisajoonis 8c–f, k). Kuigi qd17mRGA konstrukti reguleeriti süstemaatiliselt alla viie sõltumatu liini T3 taimede SAM-is, mida me üksikasjalikult iseloomustasime, suutsime analüüsida pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP konstruktiga saadud fluorestsentsmustreid (lisajoonis 8g–j, l). Selles kontrollliinis tuvastati SAM-is vaid väikesed muutused fluorestsentsi suhte osas, kuid SAM-i keskel täheldasime TagBFP-ga seotud VENUS-i selget ja ootamatut vähenemist. See kinnitab, et qmRGA poolt täheldatud signaalimismuster peegeldab mRGA-VENUS-i GA-sõltuvat degradatsiooni, kuid näitab ka, et qmRGA võib GA signaalimisaktiivsust meristeemikeskuses üle hinnata. Kokkuvõttes näitavad meie tulemused GA signaalimismustrit, mis peegeldab peamiselt algkudede jaotust. See algkudedevahelise piirkonna (IPR) jaotus on tingitud GA signaalimisaktiivsuse järkjärgulisest kinnitumisest areneva algku ja keskse piirkonna vahel, samal ajal kui GA signaalimisaktiivsus algkudes väheneb (joonis 4c, d).
GID1b ja GID1c retseptorite jaotus (vt eespool) viitab sellele, et GA retseptorite erinev ekspressioon aitab kujundada GA signaaliülekande aktiivsuse mustrit SAM-is. Me mõtlesime, kas sellega võib kaasneda GA erinev akumuleerumine. Selle võimaluse uurimiseks kasutasime nlsGPS1 GA FRET sensorit21. 100 minuti jooksul 10 μM GA4+7-ga töödeldud nlsGPS1 SAM-is tuvastati suurenenud aktivatsioonisagedus (lisajoonis 9a–e), mis näitab, et nlsGPS1 reageerib GA kontsentratsiooni muutustele SAM-is, nagu see toimub ka juurtes21. NlsGPS1 aktivatsioonisageduse ruumiline jaotus näitas SAM-i väliskihtides suhteliselt madalaid GA tasemeid, kuid näitas, et need olid SAM-i keskel ja servadel kõrgenenud (joonis 4e ja lisajoonis 9a, c). See viitab sellele, et GA on SAM-is jaotunud ka ruumilise mustriga, mis on võrreldav qmRGA abil ilmnevaga. Täiendava lähenemisviisina käsitlesime SAM-i ka fluorestseeruva GA-ga (GA3-, GA4-, GA7-Fl) või ainult Fl-iga negatiivse kontrollina. Fl-signaal jaotus kogu SAM-is, sealhulgas keskosas ja algordiumis, ehkki madalama intensiivsusega (joonis 4j ja täiendav joonis 10d). Seevastu kõik kolm GA-Fl-i akumuleerusid spetsiifiliselt algordiumi piirides ja erineval määral ülejäänud IP R-is, kusjuures GA7-Fl akumuleerus IP R suurimas domeenis (joonis 4k ja täiendav joonis 10a, b). Fluorestsentsi intensiivsuse kvantifitseerimine näitas, et IP R ja mitte-IP R intensiivsuse suhe oli GA-Fl-ga töödeldud SAM-is kõrgem võrreldes Fl-ga töödeldud SAM-iga (joonis 4l ja täiendav joonis 10c). Kokkuvõttes näitavad need tulemused, et GA esineb kõrgemates kontsentratsioonides IP R rakkudes, mis asuvad elundi piirile kõige lähemal. See viitab sellele, et SAM GA signaaliülekande aktiivsuse muster tuleneb nii GA retseptorite erinevast ekspressioonist kui ka GA erinevast akumuleerumisest IP R rakkudes elundi piiride lähedal. Seega näitas meie analüüs GA signaaliülekande ootamatut spatiotemporaalset mustrit, kus madalam aktiivsus oli SAM-i keskel ja algordiumis ning suurem aktiivsus IPR-is perifeerses piirkonnas.
Et mõista GA signaaliülekande diferentsiaalse aktiivsuse rolli SAM-is, analüüsisime GA signaaliülekande aktiivsuse, rakkude laienemise ja rakkude jagunemise vahelist korrelatsiooni, kasutades SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS reaalajas aeglustatud pildistamist. Arvestades GA rolli kasvuregulatsioonis, oli oodata positiivset korrelatsiooni rakkude laienemise parameetritega. Seetõttu võrdlesime esmalt GA signaaliülekande aktiivsuse kaarte rakkude pinna kasvukiiruse kaartidega (antud raku ja tütarrakkude jagunemise ajal toimuva laienemise tugevuse näitajana) ja kasvuanisotroopia kaartidega, mis mõõdavad rakkude laienemise suunda (kasutatakse ka siin antud raku ja tütarrakkude jagunemise ajal; joonis 5a, b, vt Meetodid ja Lisameetodid). Meie SAM-rakkude pinna kasvukiiruse kaardid on kooskõlas varasemate vaatlustega,38,39, minimaalsete kasvukiirustega piiril ja maksimaalsete kasvukiirustega arenevates õites (joonis 5a). Põhikomponentide analüüs (PCA) näitas, et GA signaaliülekande aktiivsus oli negatiivses korrelatsioonis rakkude pinna kasvu intensiivsusega (joonis 5c). Samuti näitasime, et variatsiooni peamised teljed, sealhulgas GA signaali sisend ja kasvu intensiivsus, olid ortogonaalsed kõrge CLV3 ekspressiooni poolt määratud suunaga, kinnitades rakkude välistamist SAM-tsentrist ülejäänud analüüsides. Spearmani korrelatsioonianalüüs kinnitas PCA tulemusi (joonis 5d), mis näitab, et kõrgemad GA signaalid IPR-is ei põhjustanud suuremat rakkude laienemist. Korrelatsioonianalüüs näitas aga kerget positiivset korrelatsiooni GA signaali aktiivsuse ja kasvuanisotroopia vahel (joonis 5c, d), mis viitab sellele, et kõrgem GA signaalimine IPR-is mõjutab rakkude kasvu suunda ja võimalik, et ka rakkude jagunemistasandi asendit.
a, b SAM-i keskmise pinnakasvu (a) ja kasvuanisotroopia (b) soojuskaardid, mis on keskmistatud seitsme sõltumatu taime kohta (kasutati vastavalt rakkude laienemise tugevuse ja suuna asendajatena). c PCA analüüs hõlmas järgmisi muutujaid: GA signaal, pinnakasvu intensiivsus, pinnakasvu anisotroopia ja CLV3 ekspressioon. PCA komponent 1 oli peamiselt negatiivses korrelatsioonis pinnakasvu intensiivsusega ja positiivses korrelatsioonis GA signaaliga. PCA komponent 2 oli peamiselt positiivses korrelatsioonis pinnakasvu anisotroopiaga ja negatiivses korrelatsioonis CLV3 ekspressiooniga. Protsendid esindavad iga komponendi poolt seletatavat variatsiooni. d Spearmani korrelatsioonianalüüs GA signaali, pinnakasvu intensiivsuse ja pinnakasvu anisotroopia vahel koeskaalas, välja arvatud CZ. Parempoolne number on Spearmani rho väärtus kahe muutuja vahel. Tärnid näitavad juhtumeid, kus korrelatsioon/negatiivne korrelatsioon on väga oluline. e Col-0 SAM L1 rakkude 3D visualiseerimine konfokaalse mikroskoopia abil. SAM-is (kuid mitte algkoes) 10 tunni pärast moodustunud uued rakuseinad on värvitud vastavalt nende nurkade väärtustele. Värviriba on näidatud paremas alanurgas. Sisestus näitab vastavat 3D-pilti ajahetkel 0 h. Katse korrati kaks korda sarnaste tulemustega. f Kastidiagrammid näitavad rakkude jagunemiskiirusi IPR-i ja mitte-IPR-i Col-0 SAM-is (n = 10 sõltumatut taime). Keskjoon näitab mediaani ja kasti piirid näitavad 25. ja 75. protsentiili. Vurrud näitavad R-tarkvaraga määratud minimaalseid ja maksimaalseid väärtusi. P-väärtused saadi Welchi kahepoolse t-testi abil. g, h Skemaatiline diagramm, mis näitab (g) kuidas mõõta uue rakuseina (magenta) nurka SAM-i keskpunktist (valge punktiirjoon) lähtuva radiaalsuuna suhtes (arvesse võetakse ainult teravnurga väärtusi, st 0–90°) ja (h) meristeemi ümbermõõdulist/külgmist ja radiaalsuunda. i Rakkude jagunemistasandi orientatsiooni sagedushistogrammid vastavalt SAM-il (tumesinine), IPR-il (keskmine sinine) ja mitte-IPR-il (helesinine). P-väärtused saadi kahepoolse Kolmogorov-Smirnovi testiga. Katse korrati kaks korda sarnaste tulemustega. j IPR-i rakkude jagunemistasandi orientatsiooni sagedushistogrammid vastavalt P3 (heleroheline), P4 (keskmiselt roheline) ja P5 (tumeroheline) ümber. P-väärtused saadi kahepoolse Kolmogorov-Smirnovi testiga. Katse korrati kaks korda sarnaste tulemustega.
Seetõttu uurisime järgmiseks GA signaaliülekande ja rakkude jagunemisaktiivsuse vahelist korrelatsiooni, tuvastades testi käigus äsja moodustunud rakuseinu (joonis 5e). See lähenemisviis võimaldas meil mõõta rakkude jagunemise sagedust ja suunda. Üllataval kombel leidsime, et rakkude jagunemise sagedus IP R-is ja ülejäänud SAM-is (mitte-IP R, joonis 5f) oli sarnane, mis näitab, et GA signaaliülekande erinevused IP R ja mitte-IP R rakkude vahel ei mõjuta oluliselt rakkude jagunemist. See ja positiivne korrelatsioon GA signaaliülekande ja kasvuanisotroopia vahel ajendasid meid kaaluma, kas GA signaaliülekande aktiivsus võib mõjutada rakkude jagunemistasandi orientatsiooni. Mõõtsime uue rakuseina orientatsiooni teravnurga all radiaaltelje suhtes, mis ühendab meristeemi keskpunkti ja uue rakuseina keskpunkti (joonis 5e-i) ja täheldasime selget kalduvust, et rakud jagunevad radiaaltelje suhtes umbes 90° nurga all, kusjuures kõrgeimad sagedused täheldati nurkade 70–80° (23,28%) ja 80–90° (22,62%) juures (joonis 5e,i), mis vastab rakkude jagunemisele ümbermõõdu/põikisuunas (joonis 5h). GA signaalimise panuse uurimiseks sellesse rakkude jagunemiskäitumisse analüüsisime rakkude jagunemise parameetreid IPR-is ja mitte-IPR-is eraldi (joonis 5i). Täheldasime, et IP R rakkude jagunemisnurga jaotus erines mitte-IP R rakkude või kogu SAM rakkude omast, kusjuures IP R rakkudel oli suurem külgmiste/ringikujuliste rakkude jagunemiste osakaal, st 70–80° ja 80–90° (vastavalt 33,86% ja 30,71%) (joonis 5i). Seega näitasid meie tähelepanekud seost kõrge GA signaaliülekande ja rakkude jagunemistasandi orientatsiooni vahel, mis on lähedane ümbermõõdu suunale, sarnaselt GA signaaliülekande aktiivsuse ja kasvuanisotroopia vahelise korrelatsiooniga (joonis 5c, d). Selle seose ruumilise konserveerumise edasiseks kindlakstegemiseks mõõtsime jagunemistasandi orientatsiooni IP R rakkudes, mis ümbritsevad algordiumi alates P3-st, kuna kõrgeim GA signaaliülekande aktiivsus tuvastati selles piirkonnas alates P4-st (joonis 4). IPR jagunemisnurgad P3 ja P4 ümber ei näidanud statistiliselt olulisi erinevusi, kuigi P4 ümber täheldati IPR-is külgmiste rakkude jagunemiste sageduse suurenemist (joonis 5j). P5 ümbruses asuvates IP R rakkudes muutus rakkude jagunemistasandi orientatsiooni erinevus statistiliselt oluliseks, kusjuures põikisuunaliste rakkude jagunemiste sagedus suurenes järsult (joonis 5j). Kokkuvõttes viitavad need tulemused sellele, et GA signaalimine saab kontrollida rakkude jagunemiste orientatsiooni SAM-is, mis on kooskõlas varasemate aruannetega40,41, mille kohaselt kõrge GA signaalimine võib indutseerida rakkude jagunemiste külgmist orientatsiooni IP R-is.
Ennustatakse, et IPR-i rakud ei inkorporeeru algstruktuuridesse, vaid pigem internoodidesse2,42,43. Rakkude jagunemise põikisuunaline orientatsioon IPR-is võib viia epidermise rakkude paralleelsete pikisuunaliste ridade tüüpilise organiseerumiseni internoodides. Meie eespool kirjeldatud tähelepanekud viitavad sellele, et GA signaalimine mängib selles protsessis tõenäoliselt rolli, reguleerides rakkude jagunemise suunda.
Mitme DELLA geeni funktsiooni kadumine põhjustab konstitutiivse GA vastuse ja della mutante saab kasutada selle hüpoteesi testimiseks44. Esmalt analüüsisime viie DELLA geeni ekspressioonimustreid SAM-is. GUS liini transkriptsiooniline fusioon45 näitas, et GAI, RGA, RGL1 ja RGL2 (palju vähemal määral) ekspresseerusid SAM-is (lisajoonis 11a–d). In situ hübridisatsioon näitas lisaks, et GAI mRNA akumuleerub spetsiifiliselt algetes ja arenevates õites (lisajoonis 11e). RGL1 ja RGL3 mRNA-d tuvastati kogu SAM-i võras ja vanemates õites, samas kui RGL2 mRNA oli rikkalikum piirialal (lisajoonis 11f–h). pRGL3::RGL3-GFP SAM-i konfokaalne pildistamine kinnitas in situ hübridisatsiooniga täheldatud ekspressiooni ja näitas, et RGL3 valk akumuleerub SAM-i keskosas (lisajoonis 11i). Kasutades pRGA::GFP-RGA liini, leidsime ka, et RGA valk akumuleerub SAM-is, kuid selle arvukus väheneb piiril alates P4-st (lisajoonis 11j). Märkimisväärne on see, et RGL3 ja RGA ekspressioonimustrid on kooskõlas qmRGA abil tuvastatud suurema GA signaaliülekande aktiivsusega IPR-is (joonis 4). Lisaks näitavad need andmed, et kõiki DELLA-sid ekspresseeritakse SAM-is ja et nende ekspressioon hõlmab kollektiivselt kogu SAM-i.
Järgmisena analüüsisime rakkude jagunemise parameetreid metsiktüüpi SAM-is (Ler, kontroll) ja gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della viisnurksete (globaalsete) mutantide puhul (joonis 6a, b). Huvitaval kombel täheldasime della globaalse mutandi SAM-is statistiliselt olulist nihet rakkude jagunemisnurkade sageduste jaotuses võrreldes metsiktüübiga (joonis 6c). See muutus della globaalses mutandis oli tingitud 80–90° nurkade sageduse suurenemisest (34,71% vs 24,55%) ja vähemal määral 70–80° nurkade sageduse suurenemisest (23,78% vs 20,18%), st mis vastab põikisuunalistele rakkude jagunemistele (joonis 6c). Mittepõikisuunaliste jagunemiste (0–60°) sagedus oli della globaalses mutandis samuti madalam (joonis 6c). Põikisuunaliste rakkude jagunemiste sagedus oli della globaalse mutandi SAM-is oluliselt suurenenud (joonis 6b). IPR-is oli transversaalsete rakkude jagunemiste sagedus della globaalses mutandis samuti metsiktüübiga võrreldes kõrgem (joonis 6d). Väljaspool IPR piirkonda oli metsiktüübil rakkude jagunemisnurkade jaotus ühtlasem, samas kui della globaalne mutant eelistas tangentsiaalset jagunemist nagu IPR (joonis 6e). Samuti kvantifitseerisime rakkude jagunemiste orientatsiooni ga2 oksüdaasi (ga2ox) kvintupleksmutantide (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 ja ga2ox6-2) SAM-is, mis on GA-inaktiivne mutantide taust, milles GA akumuleerub. Kooskõlas GA tasemete suurenemisega oli viiekordse ga2ox mutandi õisiku SAM suurem kui Col-0-l (lisajoonis 12a, b) ning võrreldes Col-0-ga näitas viiekordse ga2ox SAM rakkude jagunemisnurkade jaotust selgelt erinevat, kus nurga sagedus suurenes 50°-lt 90°-ni, st taas soodustas tangentsiaalset jagunemist (lisajoonis 12a–c). Seega näitame, et GA signaaliülekande konstitutiivne aktiveerimine ja GA akumuleerumine indutseerivad külgmist rakkude jagunemist IPR-is ja ülejäänud SAM-is.
a, b PI-värvitud Ler (a) ja globaalse della mutandi (b) SAM-i L1 kihi 3D visualiseering konfokaalse mikroskoopia abil. Näidatud on SAM-is (kuid mitte algstruktuuris) 10-tunnise perioodi jooksul moodustunud uued rakuseinad, mis on värvitud vastavalt nende nurkade väärtustele. Sissejoon näitab SAM-i 0 tunni möödudes. Värviriba kuvatakse paremas alanurgas. Nool (b) osutab joondatud rakufailide näitele globaalses della mutandis. Katse korrati kaks korda sarnaste tulemustega. ce rakkude jagunemistasandi orientatsioonide sagedusjaotuse võrdlus kogu SAM-is (d), IPR-is (e) ja mitte-IPR-is (f) Ler ja globaalse della vahel. P-väärtused saadi kahepoolse Kolmogorov-Smirnovi testi abil. f, g Col-0 (i) ja pCUC2::gai-1-VENUS (j) transgeensete taimede PI-värvitud SAM-i konfokaalsete kujutiste 3D visualiseering. Paneelid (a, b) näitavad SAM-is 10 tunni jooksul moodustunud uusi rakuseinu (kuid mitte algelisi rakke). Katse korrati kaks korda sarnaste tulemustega. h–j Rakkude jagunemistasandite orientatsioonide sagedusjaotuse võrdlus kogu SAM-is (h), IPR-is (i) ja mitte-IPR-is (j) Col-0 ja pCUC2::gai-1-VENUS taimede vahel. P-väärtused saadi kahepoolse Kolmogorovi-Smirnovi testi abil.
Järgmisena testisime GA signaaliülekande pärssimise mõju spetsiifiliselt IPR-is. Selleks kasutasime idulehe cup 2 (CUC2) promootorit, et juhtida VENUS-iga sulandatud dominantse negatiivse gai-1 valgu ekspressiooni (pCUC2::gai-1-VENUS liinis). Metsiktüüpi SAM-is juhib CUC2 promootor enamiku IPR-ide ekspressiooni SAM-is, sealhulgas äärisrakkudes, alates P4-st ja sarnast spetsiifilist ekspressiooni täheldati pCUC2::gai-1-VENUS taimedes (vt allpool). Rakkude jagunemisnurkade jaotus pCUC2::gai-1-VENUS taimede SAM-i või IPR-i ulatuses ei erinenud oluliselt metsiktüübi omast, kuigi ootamatult leidsime, et nendes taimedes ilma IPR-ita rakud jagunesid suurema sagedusega, 80–90° (joonis 6f–j).
On oletatud, et rakkude jagunemise suund sõltub SAM-i geomeetriast, eriti koe kõveruse tekitatud tõmbepingest46. Seetõttu küsisime, kas SAM-i kuju oli muutunud della globaalse mutandi ja pCUC2::gai-1-VENUS taimedes. Nagu varem teatatud,12 oli della globaalse mutandi SAM-i suurus suurem kui metsiktüübil (lisajoonis 13a, b, d). CLV3 ja STM RNA in situ hübridisatsioon kinnitas meristeemi laienemist della mutantidel ja näitas lisaks tüvirakkude niši külgmist laienemist (lisajoonis 13e, f, h, i). SAM-i kõverus oli aga mõlemas genotüübis sarnane (lisajoonis 13k, m, n, p). Täheldasime sarnast suuruse suurenemist gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della neljakordsel mutandil ilma kõveruse muutuseta võrreldes metsiktüübiga (lisajoonis 13c, d, g, j, l, o, p). Rakkude jagunemise orientatsiooni sagedus oli samuti della neljakordse mutandi puhul mõjutatud, kuid vähemal määral kui della monoliitses mutandis (lisajoonis 12d–f). See annuse mõju koos kõverusele mõju puudumisega viitab sellele, et RGL3 jääkaktiivsus Della neljakordses mutandis piirab DELLA aktiivsuse kadumisest tingitud muutusi rakkude jagunemise orientatsioonis ja et muutused külgmistes rakkude jagunemistes toimuvad vastusena GA signaaliülekande aktiivsuse muutustele, mitte SAM-i geomeetria muutustele. Nagu eespool kirjeldatud, juhib CUC2 promootor IPR-i ekspressiooni SAM-is alates P4-st (lisajoonis 14a, b) ja seevastu pCUC2::gai-1-VENUS SAM-il oli väiksem suurus, kuid suurem kõverus (lisajoonis 14c–h). See muutus pCUC2::gai-1-VENUS SAM-i morfoloogias võib põhjustada mehaaniliste pingete erinevat jaotust võrreldes metsiktüübiga, kus suured ümbermõõdulised pinged algavad SAM-i keskpunktist lühemal kaugusel47. Teise võimalusena võivad pCUC2::gai-1-VENUS SAM-i morfoloogia muutused tuleneda transgeeni ekspressiooni poolt indutseeritud piirkondlike mehaaniliste omaduste muutustest48. Mõlemal juhul võib see osaliselt kompenseerida GA signaaliülekande muutuste mõju, suurendades tõenäosust, et rakud jagunevad ümbermõõdulises/põikisuunas, mis selgitab meie tähelepanekuid.
Kokkuvõttes kinnitavad meie andmed, et kõrgem GA signaalimine mängib aktiivset rolli rakkude jagunemistasandi lateraalses orientatsioonis IPR-is. Samuti näitavad need, et meristeemi kõverus mõjutab samuti rakkude jagunemistasandi orientatsiooni IPR-is.
IPR-i jagunemistasapinna põikisuunaline orientatsioon, mis on tingitud GA signaaliülekande kõrgest aktiivsusest, viitab sellele, et GA eelnevalt organiseerib SAM-i epidermises radiaalse rakufaili, et määratleda rakkude organisatsiooni, mida hiljem leidub epidermise internode'is. Tõepoolest, sellised rakufailid olid sageli nähtavad della globaalsete mutantide SAM-piltidel (joonis 6b). Seega, et edasi uurida GA signaaliülekande ruumilise mustri arengufunktsiooni SAM-is, kasutasime aeglustatud pildistamist, et analüüsida rakkude ruumilist organisatsiooni IPR-is metsiktüüpi (Ler ja Col-0), della globaalsete mutantide ja pCUC2::gai-1-VENUS transgeensetes taimedes.
Leidsime, et qmRGA näitas, et GA signaaliülekande aktiivsus IPR-is suurenes P1/P2-lt ja saavutas haripunkti P4 juures ning see muster püsis aja jooksul konstantsena (joonis 4a–f ja täiendav joonis 8c–f, k). Rakkude ruumilise organisatsiooni analüüsimiseks IPR-is suureneva GA signaali korral märgistasime Ler IPR rakud P4 kohal ja külgedel vastavalt nende arengulisele saatusele, mida analüüsiti 34 tundi pärast esimest vaatlust, st rohkem kui kaks plastiidi korda, mis võimaldas meil jälgida IPR rakke algtaseme arengu ajal P1/P2-st P4-ni. Kasutasime kolme erinevat värvi: kollane nende rakkude jaoks, mis olid integreeritud algtasemesse P4 lähedal, roheline nende jaoks, mis olid IPR-is, ja lilla nende jaoks, mis osalesid mõlemas protsessis (joonis 7a–c). t0 (0 h) juures oli P4 ees nähtav 1–2 IPR rakkude kihti (joonis 7a). Nagu oodatud, tegid need rakud jagunemisel seda peamiselt põikisuunalise jagunemistasandi kaudu (joonis 7a–c). Sarnaseid tulemusi saadi ka Col-0 SAM-i abil (keskendudes P3-le, mille ääris voldib sarnaselt P4-ga Ler-is), kuigi selle genotüübi puhul peitis õie serval tekkinud volt IPR-rakud kiiremini ära (joonis 7g–i). Seega korraldab IPR-rakkude jagunemismuster rakud eelnevalt radiaalseteks ridadeks, nagu internoodides. Radiaalsete ridade organiseeritus ja IPR-rakkude lokaliseerumine järjestikuste organite vahel viitab sellele, et need rakud on internoodilised eellasrakud.
Siin arendasime ratiomeetrilise GA signaaliülekande biosensori qmRGA, mis võimaldab kvantitatiivselt kaardistada GA signaaliülekande aktiivsust, mis tuleneb GA ja GA retseptorite kombineeritud kontsentratsioonidest, minimeerides samal ajal endogeensete signaaliradade häirimist, pakkudes seeläbi teavet GA funktsiooni kohta rakulisel tasandil. Sel eesmärgil konstrueerisime modifitseeritud DELLA valgu mRGA, mis on kaotanud võime siduda DELLA interaktsioonipartnereid, kuid on endiselt tundlik GA poolt indutseeritud proteolüüsi suhtes. qmRGA reageerib nii eksogeensetele kui ka endogeensetele muutustele GA tasemes ning selle dünaamilised sensoriomadused võimaldavad hinnata GA signaaliülekande aktiivsuse aegruumilisi muutusi arengu ajal. qmRGA on ka väga paindlik tööriist, kuna seda saab kohandada erinevatele kudedele, muutes selle ekspressiooniks kasutatavat promootorit (vajadusel), ja arvestades GA signaaliülekande raja konserveerunud olemust ja PFYRE motiivi katteseemnetaimede vahel, on see tõenäoliselt ülekantav teistele liikidele22. Sellega kooskõlas näidati, et samaväärne mutatsioon riisi SLR1 DELLA valgus (HYY497AAA) pärsib SLR1 kasvurepressori aktiivsust, vähendades samal ajal vaid veidi selle GA-vahendatud lagunemist, sarnaselt mRGA23-ga. Märkimisväärselt näitasid hiljutised Arabidopsis'e uuringud, et ühe aminohappe mutatsioon PFYRE domeenis (S474L) muutis RGA transkriptsioonilist aktiivsust, mõjutamata selle võimet suhelda transkriptsioonifaktori partneritega50. Kuigi see mutatsioon on väga lähedane mRGA-s esinevatele kolmele aminohappeasendusele, näitavad meie uuringud, et need kaks mutatsiooni muudavad DELLA erinevaid omadusi. Kuigi enamik transkriptsioonifaktori partnereid seondub DELLA26,51 LHR1 ja SAW domeenidega, võivad mõned PFYRE domeeni konserveerunud aminohapped aidata neid interaktsioone stabiliseerida.
Internoodide areng on taime arhitektuuri ja saagikuse parandamise võtmeomadus. qmRGA näitas IPR internoodide eellasrakkudes kõrgemat GA signaaliülekande aktiivsust. Kvantitatiivse pildistamise ja geneetika kombineerimise abil näitasime, et GA signaaliülekande mustrid kattuvad SAM-i epidermises ringikujuliste/põikisuunaliste rakkude jagunemistasanditega, kujundades internoodide arenguks vajalikku rakkude jagunemise organisatsiooni. Arengu käigus on tuvastatud mitu rakkude jagunemistasandi orientatsiooni regulaatorit52,53. Meie töö annab selge näite sellest, kuidas GA signaaliülekande aktiivsus reguleerib seda rakulist parameetrit. DELLA saab suhelda eelnevalt voltivate valgukompleksidega41, seega võib GA signaaliülekanne reguleerida rakkude jagunemistasandi orientatsiooni, mõjutades otseselt kortikaalsete mikrotuubulite orientatsiooni40,41,54,55. Ootamatult näitasime, et SAM-is ei olnud kõrgema GA signaaliülekande aktiivsuse korrelaadiks rakkude pikenemine ega jagunemine, vaid ainult kasvuanisotroopia, mis on kooskõlas GA otsese mõjuga rakkude jagunemise suunale IPR-is. Siiski ei saa välistada, et see mõju võib olla ka kaudne, näiteks vahendatud GA-indutseeritud rakuseina pehmenemise kaudu56. Rakuseina omaduste muutused põhjustavad mehaanilist pinget57,58, mis võib mõjutada ka rakkude jagunemistasandi orientatsiooni, mõjutades kortikaalsete mikrotuubulite orientatsiooni39,46,59. GA-indutseeritud mehaanilise pinge ja GA poolt mikrotuubulite orientatsiooni otsese reguleerimise koosmõju võib olla seotud IPR-is spetsiifilise rakkude jagunemise orientatsiooni mustri loomisega, et määratleda internoodid, ja selle idee testimiseks on vaja täiendavaid uuringuid. Samuti on varasemad uuringud rõhutanud DELLA-ga interakteeruvate valkude TCP14 ja 15 olulisust internoodide moodustumise kontrollimisel60,61 ning need tegurid võivad vahendada GA toimet koos BREVIPEDICELLUS (BP) ja PENNYWISE (PNY) valkudega, mis reguleerivad internoodide arengut ja on näidanud, et need mõjutavad GA signaaliülekannet2,62. Arvestades, et DELLA-d interakteeruvad brassinosteroidide, etüleeni, jasmoonhappe ja abstsisiinhappe (ABA) signaaliradadega63,64 ja et need hormoonid võivad mõjutada mikrotuubulite orientatsiooni65, võivad GA mõju rakkude jagunemise orientatsioonile olla vahendatud ka teiste hormoonide poolt.
Varased tsütoloogilised uuringud näitasid, et nii Arabidopsis SAM-i sisemine kui ka välimine piirkond on vajalikud internoodi arenguks2,42. Asjaolu, et GA reguleerib aktiivselt rakkude jagunemist sisemistes kudedes12, toetab GA kahetist funktsiooni meristeemi ja internoodi suuruse reguleerimisel SAM-is. Suunatud rakkude jagunemise muster on SAM-i sisemises koes samuti rangelt reguleeritud ja see regulatsioon on tüve kasvu jaoks hädavajalik52. Huvitav on uurida, kas GA-l on roll ka rakkude jagunemistasandi orienteerimisel SAM-i sisemises organisatsioonis, sünkroniseerides seeläbi internoodide spetsifikatsiooni ja arengut SAM-is.
Taimi kasvatati in vitro mullas või 1% sahharoosi ja 1% agariga (Sigma) rikastatud 1x Murashige-Skoogi (MS) söötmes (Duchefa) standardtingimustes (16 h valgust, 22 °C), välja arvatud hüpokotüüli ja juurte kasvu katsed, kus seemikuid kasvatati vertikaalsetel plaatidel konstantse valguse käes ja temperatuuril 22 °C. Nitraadikatseteks kasvatati taimi modifitseeritud MS söötmel (bioWORLD taimesöötme), millele oli lisatud piisav kogus nitraati (0 või 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-suktsinaati, 1% sahharoosi ja 1% A-agari (Sigma), pikapäevatingimustes.
pDONR221-sse sisestatud GID1a cDNA rekombineeriti pDONR P4-P1R-pUBQ10-ga ja pDONR P2R-P3-mCherry-ga pB7m34GW-sse, et genereerida pUBQ10::GID1a-mCherry. pDONR221-sse sisestatud IDD2 DNA rekombineeriti pB7RWG266-ga, et genereerida p35S:IDD2-RFP. pGID1b::2xmTQ2-GID1b genereerimiseks amplifitseeriti esmalt GID1b kodeerivast piirkonnast ülesvoolu asuv 3,9 kb fragment ja GID1b cDNA-d (1,3 kb) ja terminaatorit (3,4 kb) sisaldav 4,7 kb fragment, kasutades lisatabelis 3 olevaid praimereid, seejärel sisestati need vastavalt pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) ja pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) vektoritesse ning lõpuks rekombineeriti pDONR221 2xmTQ268-ga pGreen 012567 sihtvektorisse, kasutades Gateway kloonimist. pCUC2::LSSmOrange'i genereerimiseks pandi CUC2 promootori järjestus (3229 bp ATG-st ülesvoolu), millele järgnes suure Stokesi-nihkega mOrange'i (LSSmOrange)69 kodeeriv järjestus koos N7 tuuma lokalisatsioonisignaali ja NOS transkriptsiooniterminaatoriga, pGreen kanamütsiini sihtimisvektorisse, kasutades Gateway 3-fragmendi rekombinatsioonisüsteemi (Invitrogen). Taime binaarne vektor viidi Agrobacterium tumefaciens tüvesse GV3101, Nicotiana benthamiana lehtedesse Agrobacterium infiltratsioonimeetodil ja Arabidopsis thaliana Col-0 lehtedesse õie kastmise meetodil. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry ja pCLV3::mCherry-NLS qmRGA eraldati vastavalt ristamise F3 ja F1 järglastest.
RNA in situ hübridisatsioon viidi läbi ligikaudu 1 cm pikkustel võrseotstel72, mis koguti ja fikseeriti koheselt 4 °C-ni eeljahutatud FAA lahuses (3,7% formaldehüüdi, 5% äädikhapet, 50% etanooli). Pärast 2 × 15-minutilist vaakumtöötlust vahetati fiksaator ja proove inkubeeriti üleöö. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 ja RGL3 cDNAd ja nende 3'-UTR-ide antisenss-sondid sünteesiti, kasutades Rosier jt poolt kirjeldatud lisatabelis 3 näidatud praimereid.73 Digoksigeniiniga märgistatud sondid immunodetektsiooniks kasutati digoksigeniini antikehi (3000-kordne lahjendus; Roche, katalooginumber: 11 093 274 910) ja sektsioonid värviti 5-bromo-4-kloro-3-indolüülfosfaadi (BCIP, 250-kordne lahjendus) / nitrosinise tetrasooliumi (NBT, 200-kordne lahjendus) lahusega.
Postituse aeg: 10. veebruar 2025