DELLA valgud on konserveerunudkasvuregulaatoridmillel on taimede arengus keskne roll vastusena sisemistele ja välistele signaalidele. Transkriptsiooniregulaatoritena seonduvad DELLA-d transkriptsioonifaktorite (TF) ja histooniga H2A oma GRAS-domeenide kaudu ning värvatakse promootoritele toimima. Hiljutised uuringud on näidanud, et DELLA stabiilsust reguleeritakse translatsioonijärgselt kahe mehhanismi abil: taimehormooni poolt indutseeritud polüubikvitinatsioongiberelliin, mis viib nende kiire lagunemiseni, ja konjugeerumiseni väikese ubikvitiinilaadse modifikaatoriga (SUMO), mis suurendab nende akumuleerumist. Lisaks reguleerivad DELLA aktiivsust dünaamiliselt kaks erinevat glükosüülimismehhanismi: O-fukosüülimine suurendab DELLA-TF interaktsiooni, samas kui O-seotud N-atsetüülglükoosamiini (O-GlcNAc) modifikatsioon pärsib DELLA-TF interaktsiooni. DELLA fosforüülimise roll on aga ebaselge, kuna varasemad uuringud on näidanud vastuolulisi tulemusi, kusjuures mõned viitavad sellele, et fosforüülimine soodustab või pärsib DELLA lagunemist, ja teised, et fosforüülimine ei mõjuta nende stabiilsust. Siin tuvastame fosforüülimiskohad GA1-3 repressoris (RGA), AtDELLA-s, mis on puhastatud Arabidopsis thaliana'st massispektromeetria abil, ja näitame, et kahe RGA peptiidi fosforüülimine PolyS ja PolyS/T piirkondades suurendab RGA aktiivsust, soodustades H2A sidumist ja RGA seostumist sihtpromootoritega. Märkimisväärne on, et fosforüülimine ei mõjutanud RGA-TF interaktsioone ega RGA stabiilsust. Meie uuring paljastab molekulaarse mehhanismi, mille abil fosforüülimine indutseerib DELLA aktiivsust.
Meie massispektromeetriline analüüs näitas, et nii Pep1 kui ka Pep2 olid GA-defitsiidiga Ga1 taustal RGA-s tugevalt fosforüülitud. Lisaks sellele uuringule on fosfoproteoomilised uuringud näidanud ka Pep1 fosforüülimist RGA-s, kuigi selle rolli pole veel uuritud53,54,55. Seevastu Pep2 fosforüülimist pole varem kirjeldatud, kuna seda peptiidi sai tuvastada ainult RGAGKG transgeeni abil. Kuigi m1A mutatsioon, mis kaotas Pep1 fosforüülimise, vähendas RGA aktiivsust planta's vaid veidi, oli sellel m2A-ga kombineerituna RGA aktiivsuse vähendamisel aditiivne toime (lisajoonis 6). Oluline on see, et Pep1 fosforüülimine oli GA-võimendatud sly1 mutandis ga1-ga võrreldes oluliselt vähenenud, mis viitab sellele, et GA soodustab RGA defosforüülimist, vähendades selle aktiivsust. Mehhanism, mille abil GA RGA fosforüülimist pärsib, vajab edasist uurimist. Üks võimalus on, et see saavutatakse tuvastamata proteiinkinaasi regulatsiooni kaudu. Kuigi uuringud on näidanud, et GA vähendab riisis CK1 proteiinkinaasi EL1 ekspressiooni,41 näitavad meie tulemused, et Arabidopsis EL1 homoloogi (AEL1-4) kõrgema järgu mutatsioonid ei vähenda RGA fosforüülimist. Meie tulemustega kooskõlas ei tuvastanud hiljutine fosfoproteoomiline uuring, milles kasutati Arabidopsis AEL üleekspresseerivaid liine ja ael kolmikmutanti, ühtegi DELLA valku nende kinaaside substraatidena56. Käsikirja ettevalmistamise ajal teatati, et GSK3, nisu (Triticum aestivum) GSK3/SHAGGY-laadset kinaasi kodeeriv geen, võib fosforüülida DELLA-d (Rht-B1b)57, kuigi Rht-B1b fosforüülimist GSK3 abil ei ole planta-s kinnitatud. In vitro ensümaatilised reaktsioonid GSK3 juuresolekul, millele järgnes massispektromeetriline analüüs, näitasid kolme fosforüülimiskohta, mis paiknesid Rht-B1b DELLA ja GRAS domeenide vahel (lisajoonis 3). Seriini ja alaniini asendused kõigis kolmes fosforüülimissaidis põhjustasid transgeenses nisus Rht-B1b aktiivsuse vähenemist, mis on kooskõlas meie leidudega, et alaniini asendused Pep2 RGA-s vähendasid RGA aktiivsust. In vitro valgu lagunemise testid näitasid aga veelgi, et fosforüülimine võib stabiliseerida ka Rht-B1b57. See on vastuolus meie tulemustega, mis näitavad, et alaniini asendused Pep2 RGA-s ei muuda selle stabiilsust planta's. Nisu GSK3 on brassinosteroididele mittetundliku valgu 2 (BIN2) ortoloog Arabidopsis'es 57. BIN2 on BR signaaliülekande negatiivne regulaator ja BR aktiveerib selle signaaliülekande rada, põhjustades BIN2 lagunemist 58. Näitasime, et BR-töötlus ei vähenda RGA stabiilsust 59 ega fosforüülimise taset Arabidopsis'es (lisajoonis 2), mis viitab sellele, et RGA-d BIN2 tõenäoliselt ei fosforüüli.
Kõiki kvantitatiivseid andmeid analüüsiti statistiliselt Exceli abil ja olulised erinevused määrati Studendi t-testi abil. Valimi suuruse eelnevaks määramiseks ei kasutatud statistilisi meetodeid. Analüüsist ei jäetud ühtegi andmestikku välja; katset ei randomiseeritud; ja teadlased olid katse ja tulemuste hindamise ajal jaotusest teadlikud. Valimi suurused on esitatud jooniste legendides ja toorandmete failides.
Postituse aeg: 15. aprill 2025