DELLA valgud on konserveeritudkasvuregulaatoridmis mängivad taimede arengus keskset rolli vastusena sisemistele ja välistele signaalidele. Transkriptsiooniregulaatoritena seonduvad DELLA-d oma GRAS-domeenide kaudu transkriptsioonifaktoritega (TF) ja histooni H2A-ga ning värvatakse promootoritele toimima. Hiljutised uuringud on näidanud, et DELLA stabiilsust reguleerivad translatsioonijärgselt kaks mehhanismi: taimehormooni poolt indutseeritud polüubikvitinatsioon.giberelliin, mis põhjustab nende kiiret lagunemist ja konjugatsiooni väikese ubikvitiinilaadse modifikaatoriga (SUMO), mis suurendab nende akumuleerumist. Veelgi enam, DELLA aktiivsust reguleerivad dünaamiliselt kaks erinevat glükosüülimismehhanismi: O-fukosüülimine suurendab DELLA-TF interaktsiooni, samas kui O-seotud N-atsetüülglükoosamiini (O-GlcNAc) modifikatsioon inhibeerib DELLA-TF interaktsiooni. DELLA fosforüülimise roll on siiski ebaselge, kuna varasemad uuringud on näidanud vastuolulisi tulemusi, millest mõned viitavad sellele, et fosforüülimine soodustab või pärsib DELLA lagunemist ja teised viitavad sellele, et fosforüülimine ei mõjuta nende stabiilsust. Siin tuvastame fosforüülimiskohad GA1-3 repressoris (RGA), AtDELLA, mis on puhastatud Arabidopsis thalianast massispektromeetria abil, ja näitame, et kahe RGA peptiidi fosforüülimine PolyS ja PolyS / T piirkondades suurendab RGA aktiivsust, soodustades H2A seondumist ja RGA seost sihtpromootoritega. Eelkõige ei mõjutanud fosforüülimine RGA-TF interaktsioone ega RGA stabiilsust. Meie uuring paljastab molekulaarse mehhanismi, mille abil fosforüülimine kutsub esile DELLA aktiivsuse.
Meie massispektromeetriline analüüs näitas, et nii Pep1 kui ka Pep2 olid GA-puuduliku Ga1 taustal RGA-s tugevalt fosforüülitud. Lisaks sellele uuringule on fosfoproteoomilised uuringud näidanud ka Pep1 fosforüülimist RGA-s, kuigi selle rolli pole veel uuritud53,54,55. Seevastu Pep2 fosforüülimist ei ole varem kirjeldatud, kuna seda peptiidi sai tuvastada ainult RGAGKG transgeeni abil. Kuigi m1A mutatsioon, mis kaotas Pep1 fosforüülimise, vähendas RGA aktiivsust taimes vaid veidi, oli sellel kombineerituna m2A-ga RGA aktiivsuse vähendamisel aditiivne toime (täiendav joonis 6). Oluline on see, et Pep1 fosforüülimine vähenes oluliselt GA-ga täiustatud sly1 mutandis võrreldes ga1-ga, mis viitab sellele, et GA soodustab RGA defosforüülimist, vähendades selle aktiivsust. Mehhanism, mille abil GA pärsib RGA fosforüülimist, vajab täiendavat uurimist. Üks võimalus on see, et see saavutatakse tundmatu proteiinkinaasi reguleerimise kaudu. Kuigi uuringud on näidanud, et CK1 proteiinkinaasi EL1 ekspressiooni reguleerib riisis GA alla41, näitavad meie tulemused, et Arabidopsis EL1 homoloogi (AEL1-4) kõrgema järgu mutatsioonid ei vähenda RGA fosforüülimist. Kooskõlas meie tulemustega ei tuvastanud hiljutine fosfoproteoomiline uuring, milles kasutati Arabidopsis AEL üleekspresseerivaid liine ja ael kolmikmutanti, nende kinaaside substraatidena ühtegi DELLA valku56. Käsikirja ettevalmistamisel teatati, et GSK3, nisus (Triticum aestivum) GSK3 / SHAGGY-sarnast kinaasi kodeeriv geen, võib fosforüülida DELLA (Rht-B1b)57, kuigi Rht-B1b fosforüülimist GSK3 poolt ei ole taimedes kinnitatud. In vitro ensümaatilised reaktsioonid GSK3 juuresolekul, millele järgnes massispektromeetria analüüs, näitasid kolm fosforüülimissaiti, mis paiknesid Rht-B1b DELLA ja GRAS domeenide vahel (täiendav joonis 3). Seriini ja alaniini asendused kõigis kolmes fosforüülimissaidis vähendasid Rht-B1b aktiivsust transgeenses nisus, mis on kooskõlas meie järeldustega, et alaniini asendused Pep2 RGA-s vähendasid RGA aktiivsust. Kuid in vitro valgu lagunemise testid näitasid veel, et fosforüülimine võib samuti stabiliseerida Rht-B1b57. See on vastupidine meie tulemustele, mis näitavad, et alaniini asendused Pep2 RGA-s ei muuda selle stabiilsust taimes. GSK3 nisus on brassinosteroidide suhtes mittetundliku valgu 2 (BIN2) ortoloog Arabidopsis 57-s. BIN2 on BR signaaliülekande negatiivne regulaator ja BR aktiveerib oma signaaliraja, põhjustades BIN2 lagunemist 58. Näitasime, et BR-ravi ei vähenda RGA stabiilsust 59. mis viitab sellele, et tõenäoliselt ei fosforüüli BIN2 RGA-d.
Kõiki kvantitatiivseid andmeid analüüsiti statistiliselt Exceli abil ning olulised erinevused määrati Studenti t-testi abil. Valimi suuruse eelmääramiseks ei kasutatud statistilisi meetodeid. Analüüsist ei jäetud välja andmeid; katset ei randomiseeritud; ja teadlased olid eksperimendi ja tulemuste hindamise ajal jaotusest teadlikud. Näidiste suurused on toodud jooniste legendides ja algandmefailides.
Postitusaeg: 15. aprill 2025