See uuring hindas kaubanduslike ainete letaalsust, subletaalsust ja toksilisust.tsüpermetriinpreparaatide mõju kahepaiksetele kullestele. Ägeda toksilisuse testis testiti 96 tunni jooksul kontsentratsioone 100–800 μg/l. Kroonilise toksilisuse testis testiti looduslikult esinevaid tsüpermetriini kontsentratsioone (1, 3, 6 ja 20 μg/l) suremuse suhtes, millele järgnes mikrotuumade testimine ja punaste vereliblede tuumaanomaaliate testimine 7 päeva jooksul. Kaubandusliku tsüpermetriini preparaadi LC50 kullestele oli 273,41 μg L−1. Kroonilises testis põhjustas kõrgeim kontsentratsioon (20 μg L−1) enam kui 50% suremuse, kuna see tappis pooled testitud kullestest. Mikrotuumade test näitas olulisi tulemusi 6 ja 20 μg L−1 juures ning tuvastati mitu tuumaanomaaliat, mis näitab, et kaubanduslikul tsüpermetriini preparaadil on genotoksiline potentsiaal P. gracilis'e vastu. Tsüpermetriin on selle liigi jaoks kõrge riskiga, mis näitab, et see võib põhjustada mitmeid probleeme ja mõjutada selle ökosüsteemi dünaamikat nii lühikeses kui ka pikas perspektiivis. Seetõttu võib järeldada, et kaubanduslikel tsüpermetriini preparaatidel on P. gracilis'ele toksiline toime.
Põllumajandustegevuse pideva laienemise ja intensiivse kasutamise tõttukahjuritõrjemeetmetega puutuvad veeloomad sageli kokku pestitsiididega1,2. Põllumajanduspõldude lähedal asuvate veevarude reostus võib mõjutada mittesihtorganismide, näiteks kahepaiksete arengut ja ellujäämist.
Kahepaiksed on keskkonnamaatriksite hindamisel üha olulisemad. Kahepaikseid peetakse headeks keskkonnasaasteainete bioindikaatoriteks tänu nende ainulaadsetele omadustele, nagu keerulised elutsüklid, vastsete kiire kasvukiirus, troofiline seisund, läbilaskev nahk10,11, paljunemiseks vajalik sõltuvus veest12 ja kaitsmata munad11,13,14. Väike veekonn (Physalaemus gracilis), tuntud ka kui nuttev konn, on osutunud pestitsiidireostuse bioindikaatorliigiks4,5,6,7,15. Liiki leidub seisvates vetes, kaitsealadel või varieeruva elupaigaga aladel Argentinas, Uruguays, Paraguays ja Brasiilias1617 ning IUCN-i klassifikatsiooni kohaselt peetakse seda stabiilseks oma laia leviku ja erinevate elupaikade taluvuse tõttu18.
Kahepaiksetel on pärast tsüpermetriiniga kokkupuudet teatatud subletaalsetest mõjudest, sealhulgas kulleste käitumuslikud, morfoloogilised ja biokeemilised muutused23,24,25, muutunud suremus ja metamorfoosi aeg, ensümaatilised muutused, vähenenud koorumisedukus24,25, hüperaktiivsus26, koliinesteraasi aktiivsuse pärssimine27 ja muutused ujumisvõimes7,28. Tsüpermetriini genotoksilise toime uuringud kahepaiksetel on aga piiratud. Seetõttu on oluline hinnata kahepaiksete liikide tundlikkust tsüpermetriini suhtes.
Keskkonnareostus mõjutab kahepaiksete normaalset kasvu ja arengut, kuid kõige tõsisem kahjulik mõju on pestitsiididega kokkupuutest tingitud DNA geneetiline kahjustus13. Vererakkude morfoloogia analüüs on oluline bioindikaator reostuse ja aine võimaliku toksilisuse kohta metsikutele liikidele29. Mikrotuumade test on üks levinumaid meetodeid kemikaalide genotoksilisuse määramiseks keskkonnas30. See on kiire, tõhus ja odav meetod, mis on hea näitaja organismide, näiteks kahepaiksete keemilisest reostusest31,32 ja annab teavet kokkupuute kohta genotoksiliste saasteainetega33.
Selle uuringu eesmärk oli hinnata kaubanduslike tsüpermetriini preparaatide toksilist potentsiaali väikestele vees elavatele kullestele, kasutades mikrotuumade testi ja ökoloogilise riski hindamist.
Katse ägeda perioodi jooksul erinevate kaubandusliku tsüpermetriini kontsentratsioonidega kokkupuutunud P. gracilis kulleste kumulatiivne suremus (%).
Kroonilise toksilisuse testi käigus erinevate kaubandusliku tsüpermetriini kontsentratsioonidega kokkupuutunud P. gracilis kulleste kumulatiivne suremus (%).
Täheldatud kõrge suremus oli tingitud genotoksilisest toimest kahepaiksetel, kes puutusid kokku tsüpermetriini erinevate kontsentratsioonidega (6 ja 20 μg/l), mida tõendab mikrotuumade (MN) ja tuumaanomaaliate esinemine erütrotsüütides. MN moodustumine viitab mitoosi vigadele ja on seotud kromosoomide halva seondumisega mikrotuubulitega, defektidega kromosoomide omastamise ja transpordi eest vastutavates valgukompleksides, vigadega kromosoomide segregatsioonis ja vigadega DNA kahjustuste parandamises38,39 ning võib olla seotud pestitsiidide poolt põhjustatud oksüdatiivse stressiga40,41. Teisi kõrvalekaldeid täheldati kõigi hinnatud kontsentratsioonide juures. Tsüpermetriini kontsentratsiooni suurenemine suurendas tuumaanomaaliaid erütrotsüütides vastavalt 5% ja 20% madalaima (1 μg/l) ja kõrgeima (20 μg/l) annuse korral. Näiteks võivad liigi DNA muutused avaldada tõsiseid tagajärgi nii lühi- kui ka pikaajalisele ellujäämisele, mille tulemuseks on populatsiooni vähenemine, muutunud reproduktiivne sobivus, sugulusaretus, geneetilise mitmekesisuse vähenemine ja muutunud rändekiirus. Kõik need tegurid võivad mõjutada liikide ellujäämist ja säilimist42,43. Erütroidsete anomaaliate teke võib viidata tsütokineesi blokeerimisele, mille tulemuseks on ebanormaalne rakkude jagunemine (kahetuumalised erütrotsüüdid)44,45; mitmesagaralised tuumad on tuumamembraani eendid mitme sagaraga46, samas kui teised erütroidsed anomaaliad võivad olla seotud DNA amplifikatsiooniga, näiteks tuumaneerud/munad47. Tuumata erütrotsüütide olemasolu võib viidata hapniku transpordi häirele, eriti saastunud vees48,49. Apoptoos näitab rakkude surma50.
Ka teised uuringud on näidanud tsüpermetriini genotoksilist toimet. Kabaña jt51 näitasid Odontophrynus americanus rakkudes mikrotuumade ja tuumamuutuste, näiteks kahetuumaliste rakkude ja apoptootiliste rakkude esinemist pärast kokkupuudet tsüpermetriini kõrge kontsentratsiooniga (5000 ja 10 000 μg L−1) 96 tunni jooksul. Tsüpermetriini poolt indutseeritud apoptoosi tuvastati ka P. biligonigerus52 ja Rhinella arenarum53 puhul. Need tulemused viitavad sellele, et tsüpermetriinil on genotoksiline toime paljudele veeorganismidele ning et MN ja ENA test võib olla kahepaiksetele avalduva subletaalse toime näitajaks ning olla rakendatav toksiliste ainetega kokkupuutunud kohalikele liikidele ja metsikutele populatsioonidele12.
Tsüpermetriini kaubanduslikud preparaadid kujutavad endast suurt keskkonnaohtu (nii ägedat kui ka kroonilist), kusjuures HQ-d ületavad USA Keskkonnakaitseagentuuri (EPA) taset54, mis võib keskkonnas esinemise korral liikidele kahjulik olla. Kroonilise riski hindamisel oli suremuse NOEC 3 μg L−1, mis kinnitab, et vees leiduvad kontsentratsioonid võivad liigile ohtu kujutada55. Endosulfaani ja tsüpermetriini seguga kokkupuutunud R. arenarum vastsete surmav NOEC oli 168 tunni pärast 500 μg L−1; see väärtus langes 336 tunni pärast 0,0005 μg L−1-ni. Autorid näitavad, et mida pikem on kokkupuude, seda madalamad on liigile kahjulikud kontsentratsioonid. Samuti on oluline rõhutada, et NOEC väärtused olid samal kokkupuuteajal kõrgemad kui P. gracilis'el, mis näitab, et liigi reaktsioon tsüpermetriinile on liigispetsiifiline. Lisaks suremuse osas ulatus P. gracilis'e CHQ väärtus pärast kokkupuudet tsüpermetriiniga 64,67-ni, mis on kõrgem kui USA Keskkonnakaitseagentuuri kehtestatud kontrollväärtus54, ja R. arenarum'i vastsete CHQ väärtus oli samuti sellest väärtusest kõrgem (CHQ > 388,00 pärast 336 tundi), mis näitab, et uuritud insektitsiidid kujutavad endast suurt ohtu mitmetele kahepaikseliikidele. Arvestades, et P. gracilis'el kulub metamorfoosi täielikuks muutumiseks umbes 30 päeva,56 võib järeldada, et uuritud tsüpermetriini kontsentratsioonid võivad aidata kaasa populatsiooni vähenemisele, takistades nakatunud isendite sisenemist täiskasvanu- või paljunemisjärgus varases eas.
Mikrotuumade ja teiste erütrotsüütide tuumaanomaaliate arvutatud riskihinnangus jäid CHQ väärtused vahemikku 14,92–97,00, mis näitab, et tsüpermetriinil on potentsiaalne genotoksiline oht P. gracilis'ele isegi tema looduslikus elupaigas. Suremust arvesse võttes oli P. gracilis'ele talutav ksenobiootiliste ühendite maksimaalne kontsentratsioon 4,24 μg L−1. Siiski näitasid genotoksilist toimet ka nii madalad kontsentratsioonid kui 1 μg/l. See asjaolu võib viia ebanormaalsete isendite arvu suurenemiseni57 ning mõjutada liikide arengut ja paljunemist nende elupaikades, mis omakorda viib kahepaiksete populatsioonide vähenemiseni.
Insektitsiidi tsüpermetriini kaubanduslikud preparaadid näitasid P. gracilis'ele suurt ägedat ja kroonilist toksilisust. Täheldati kõrgemat suremust, mis oli tõenäoliselt tingitud toksilistest mõjudest, mida tõendas mikrotuumade ja erütrotsüütide tuumaanomaaliate esinemine, eriti sakiliste, lobe- ja vesikulaarsete tuumade puhul. Lisaks näitasid uuritud liigid suurenenud keskkonnariske, nii ägedaid kui ka kroonilisi. Need andmed koos meie uurimisrühma varasemate uuringutega näitasid, et isegi erinevad tsüpermetriini kaubanduslikud preparaadid põhjustasid ikkagi atsetüülkoliinesteraasi (AChE) ja butürüülkoliinesteraasi (BChE) aktiivsuse vähenemist ja oksüdatiivset stressi58 ning põhjustasid muutusi ujumisaktiivsuses ja suuõõne väärarenguid59 P. gracilis'el, mis näitab, et tsüpermetriini kaubanduslikel preparaatidel on sellele liigile kõrge letaalne ja subletaalne toksilisus. Hartmann jt. 60 leidsid, et tsüpermetriini kaubanduslikud preparaadid olid P. gracilis'ele ja sama perekonna teisele liigile (P. cuvieri) kõige toksilisemad võrreldes üheksa teise pestitsiidiga. See viitab sellele, et keskkonnakaitseks seaduslikult heakskiidetud tsüpermetriini kontsentratsioonid võivad põhjustada suurt suremust ja pikaajalist populatsiooni vähenemist.
Pestitsiidi toksilisuse hindamiseks kahepaiksetele on vaja täiendavaid uuringuid, kuna keskkonnas leiduvad kontsentratsioonid võivad põhjustada suurt suremust ja kujutada endast potentsiaalset ohtu P. gracilis'ele. Kahepaiksete liikide uuringuid tuleks julgustada, kuna andmeid nende organismide, eriti Brasiilia liikide kohta on vähe.
Kroonilise toksilisuse test kestis staatilistes tingimustes 168 tundi (7 päeva) ja subletaalsed kontsentratsioonid olid: 1, 3, 6 ja 20 μg ai L−1. Mõlemas katses hinnati 10 kullest igas ravirühmas kuue kordusega, kokku 60 kullest kontsentratsiooni kohta. Samal ajal toimis ainult veega töödeldud rühm negatiivse kontrollina. Iga katseseade koosnes steriilsest klaasnõust mahutavusega 500 ml ja tihedusega 1 kulles 50 ml lahuse kohta. Kolb kaeti polüetüleenkilega aurustumise vältimiseks ja seda pidevalt aereeriti.
Vee keemilise analüüsi abil määrati pestitsiidide kontsentratsioon ajahetkedel 0, 96 ja 168 tundi. Sabin jt 68 ja Martins jt 69 andmetel viidi analüüsid läbi Santa Maria föderaalülikooli pestitsiidide analüüsi laboris (LARP), kasutades gaasikromatograafiat koos kolmik-kvadrupool-massispektromeetriaga (Varian model 1200, Palo Alto, California, USA). Pestitsiidide kvantitatiivne määramine vees on esitatud lisamaterjalina (tabel SM1).
Mikrotuuma testi (MNT) ja punaste vereliblede tuumaanomaaliate testi (RNA) jaoks analüüsiti igast ravirühmast 15 kullest. Kullesed tuimestati 5% lidokaiiniga (50 mg g-170) ja vereproovid koguti südamepunktsiooni teel, kasutades ühekordselt kasutatavaid hepariniseeritud süstlaid. Vereplaigud valmistati steriilsetele mikroskoobi slaididele, kuivatati õhu käes, fikseeriti 100% metanooliga (4 °C) 2 minutit ja seejärel värviti 10% Giemsa lahusega 15 minutit pimedas. Protsessi lõpus pesti slaide destilleeritud veega liigse värvaine eemaldamiseks ja kuivatati toatemperatuuril.
Igast kullesest võetud vähemalt 1000 punast verelible analüüsiti 100× mikroskoobi ja 71 objektiivi abil, et määrata MN ja ENA olemasolu. Kokku hinnati 75 796 kulleselt võetud punast verelible, arvestades tsüpermetriini kontsentratsioone ja kontrollrühmi. Genotoksilisust analüüsiti Carrasco jt ja Fenechi jt meetodi kohaselt38,72, määrates järgmiste tuumakahjustuste sageduse: (1) tuumata rakud: tuumadeta rakud; (2) apoptootilised rakud: tuuma fragmentatsioon, programmeeritud rakusurm; (3) kahetuumalised rakud: kahe tuumaga rakud; (4) tuumapungad või mullid: rakud, mille tuumal on väikesed tuumamembraani eendid, mullid, mis on mikrotuumadega sarnased; (5) karüolüüsitud rakud: rakud, millel on ainult tuuma kontuur ilma sisemise materjalita; (6) sälguga rakud: rakud, mille tuumal on ilmsed praod või sälgud, mida nimetatakse ka neerukujulisteks tuumadeks; (7) lobulaarsed rakud: rakud, mille tuuma eendid on suuremad kui eelpoolmainitud vesiikulid; ja (8) mikrorakud: rakud, millel on kondenseerunud tuum ja vähenenud tsütoplasma. Muutusi võrreldi negatiivsete kontrollide tulemustega.
Ägeda toksilisuse testi tulemusi (LC50) analüüsiti GBasic tarkvara ja TSK-Trimmed Spearman-Karberi meetodi abil74. Kroonilise testi andmeid testiti eelnevalt vea normaalsuse (Shapiro-Wilksi) ja dispersiooni homogeensuse (Bartlett) suhtes. Tulemusi analüüsiti ühesuunalise dispersioonanalüüsi (ANOVA) abil. Andmete omavaheliseks võrdlemiseks kasutati Tukey testi ja ravirühma ning negatiivse kontrollrühma andmete võrdlemiseks Dunnetti testi.
LOEC ja NOEC andmeid analüüsiti Dunnetti testi abil. Statistilised testid viidi läbi Statistica 8.0 tarkvaraga (StatSoft), olulisuse tase oli 95% (p < 0,05).
Postituse aeg: 13. märts 2025