Selles uuringus hinnati kaubandusliku toote letaalsust, subletaalsust ja toksilisusttsüpermetriinpreparaadid anuraani kullestele. Akuutses testis testiti kontsentratsioone 100–800 μg/L 96 tunni jooksul. Kroonilises testis testiti looduslikult esinevaid tsüpermetriini kontsentratsioone (1, 3, 6 ja 20 μg/L) suremuse suhtes, millele järgnes mikrotuumade testimine ja punaste vereliblede tuumade kõrvalekalded 7 päeva jooksul. Kaubandusliku tsüpermetriini preparaadi LC50 kullestele oli 273,41 μg L-1. Kroonilises testis põhjustas kõrgeim kontsentratsioon (20 μg L-1) rohkem kui 50% suremust, kuna see tappis pooled testitud kullestest. Mikrotuumatest näitas olulisi tulemusi 6 ja 20 μg L−1 juures ning tuvastati mitmeid tuumahäireid, mis näitavad, et kaubanduslikul tsüpermetriini preparaadil on genotoksiline potentsiaal P. gracilise suhtes. Tsüpermetriin on selle liigi jaoks suur risk, mis näitab, et see võib põhjustada mitmeid probleeme ja mõjutada selle ökosüsteemi dünaamikat nii lühemas kui ka pikemas perspektiivis. Seetõttu võib järeldada, et kaubanduslikel tsüpermetriini preparaatidel on P. gracilisele toksiline toime.
Põllumajandustegevuse pideva laienemise ja intensiivse kasutamise tõttukahjuritõrjemeetmete kohaselt puutuvad veeloomad sageli pestitsiididega kokku1,2. Veevarude saastamine põllumajanduspõldude läheduses võib mõjutada mittesihtorganismide, näiteks kahepaiksete arengut ja ellujäämist.
Kahepaiksed muutuvad keskkonnamaatriksite hindamisel üha olulisemaks. Anuraane peetakse headeks keskkonnasaasteainete bioindikaatoriteks nende ainulaadsete omaduste tõttu, nagu keerulised elutsüklid, vastsete kiire kasvukiirus, troofiline seisund, läbilaskev nahk10,11, paljunemisvõime veest sõltuv12 ja kaitsmata munad11,13,14. Väike vesikonn (Physalaemus gracilis), üldtuntud kui nuttev konn, on osutunud pestitsiidreostuse bioindikaatoriks4,5,6,7,15. Seda liiki leidub Argentiinas, Uruguays, Paraguays ja Brasiilias seisuvetes, kaitsealadel või muutuva elupaigaga aladel1617 ning IUCNi klassifikatsiooni järgi peetakse seda stabiilseks tänu oma laiale levikule ja erinevate elupaikade taluvusele18.
Kahepaiksetel on teatatud subletaalsetest mõjudest pärast kokkupuudet tsüpermetriiniga, sealhulgas käitumis-, morfoloogilised ja biokeemilised muutused kullestes23, 24, 25, suremuse ja metamorfoosi aja muutus, ensümaatilised muutused, koorumise edukuse vähenemine24, 25, hüperaktiivsus26, koliinesteraasi aktiivsuse muutuste inhibeerimine27 ja 8 . Siiski on tsüpermetriini genotoksilise toime uuringud kahepaiksetel piiratud. Seetõttu on oluline hinnata anuraaniliikide tundlikkust tsüpermetriini suhtes.
Keskkonnareostus mõjutab kahepaiksete normaalset kasvu ja arengut, kuid kõige tõsisem kahjulik mõju on pestitsiididega kokkupuutest põhjustatud DNA geneetiline kahjustus13. Vererakkude morfoloogia analüüs on oluline bioindikaator reostuse ja aine potentsiaalse mürgisuse kohta metsikutele liikidele29. Mikrotuumatest on üks enamkasutatavaid meetodeid keskkonnas leiduvate kemikaalide genotoksilisuse määramiseks30. See on kiire, tõhus ja odav meetod, mis näitab hästi organismide (nt kahepaiksete) keemilist reostust31,32 ja võib anda teavet kokkupuute kohta genotoksiliste saasteainetega33.
Selle uuringu eesmärk oli hinnata kaubanduslike tsüpermetriini preparaatide toksilist potentsiaali väikestele vees elavatele kullestele, kasutades mikrotuumatesti ja ökoloogilise riski hindamist.
P. gracilis kulleste kumulatiivne suremus (%), mis on katse ägeda perioodi jooksul kokku puutunud kaubandusliku tsüpermetriini erinevate kontsentratsioonidega.
P. gracilis kulleste kumulatiivne suremus (%), kes on kroonilise testi käigus kokku puutunud kaubandusliku tsüpermetriini erinevate kontsentratsioonidega.
Täheldatud kõrge suremus tulenes genotoksilistest mõjudest kahepaiksetel, kes puutusid kokku erineva kontsentratsiooniga tsüpermetriini (6 ja 20 μg/L), mida tõendavad mikrotuumade (MN) olemasolu ja tuumaanomaaliad erütrotsüütides. MN-i moodustumine näitab vigu mitoosis ja on seotud kromosoomide kehva seondumisega mikrotuubulitega, kromosoomide omastamise ja transpordi eest vastutavate valgukomplekside defektidega, kromosoomide segregatsiooni vigadega ja DNA kahjustuste parandamise vigadega 38, 39 ning võib olla seotud pestitsiidide põhjustatud oksüdatiivse stressiga 40, 41. Kõigil hinnatud kontsentratsioonidel täheldati muid kõrvalekaldeid. Tsüpermetriini kontsentratsiooni suurenemine suurendas erütrotsüütide tuumaanomaaliaid vastavalt 5% ja 20% võrra madalaima (1 μg/L) ja suurima (20 μg/L) annuse korral. Näiteks võivad muutused liigi DNA-s avaldada tõsiseid tagajärgi nii lühi- kui ka pikaajalisele ellujäämisele, mille tulemuseks on populatsiooni vähenemine, paljunemisvõime muutumine, sugulusaretus, geneetilise mitmekesisuse kadu ja migratsioonimäärade muutumine. Kõik need tegurid võivad mõjutada liikide ellujäämist ja säilimist42,43. Erütroidi anomaaliate teke võib viidata tsütokineesi blokeerimisele, mille tulemuseks on rakkude ebanormaalne jagunemine (kahetuumalised erütrotsüüdid)44,45; mitmeharulised tuumad on tuumamembraani väljaulatuvad osad, millel on mitu lobet46, samas kui DNA amplifikatsiooniga võivad kaasneda muud erütroidsed kõrvalekalded, näiteks tuumaneerud/verevillid47. Tuumatud erütrotsüütide olemasolu võib viidata hapniku transpordi häirele, eriti saastunud vees48,49. Apoptoos näitab rakusurma50.
Teised uuringud on samuti näidanud tsüpermetriini genotoksilist toimet. Kabaña jt 51 näitasid mikrotuumade ja tuumamuutuste, nagu kahetuumalised rakud ja apoptootilised rakud, esinemist Odontophrynus americanuse rakkudes pärast 96-tunnist kokkupuudet kõrge tsüpermetriini kontsentratsiooniga (5000 ja 10 000 μg L-1). Tsüpermetriinist indutseeritud apoptoos tuvastati ka P. biligonigerus52 ja Rhinella arenarum53 puhul. Need tulemused viitavad sellele, et tsüpermetriinil on genotoksiline toime paljudele veeorganismidele ning et MN- ja ENA-analüüs võib olla kahepaiksetele avalduva subletaalse mõju indikaator ning seda võib kasutada kohalike liikide ja toksiliste ainetega kokku puutunud looduslike populatsioonide puhul12.
Tsüpermetriini kaubanduslikud preparaadid kujutavad endast suurt keskkonnaohtu (nii ägedat kui ka kroonilist), peakorterid ületavad USA Keskkonnakaitseagentuuri (EPA) taset54, mis võib keskkonnas esinevaid liike kahjustada. Kroonilise riski hindamisel oli suremuse NOEC 3 μg L−1, mis kinnitab, et vees leitud kontsentratsioonid võivad ohustada liike55. Endosulfaani ja tsüpermetriini seguga kokku puutunud R. arenarum vastsete surmav NOEC oli 168 tunni pärast 500 μg L−1; see väärtus vähenes 336 tunni pärast 0,0005 μg L-1-ni. Autorid näitavad, et mida pikem on kokkupuude, seda madalamad on liigile kahjulikud kontsentratsioonid. Samuti on oluline rõhutada, et NOEC väärtused olid samal kokkupuuteajal kõrgemad kui P. gracilis, mis näitab, et liigi vastus tsüpermetriinile on liigispetsiifiline. Lisaks saavutas P. gracilise CHQ väärtus pärast kokkupuudet tsüpermetriiniga 64,67-ni, mis on kõrgem kui USA Keskkonnakaitseagentuuri54 kehtestatud kontrollväärtus, ning R. arenarum vastsete CHQ väärtus oli samuti kõrgem (CHQ > 388,00 pärast 336 tundi), mis näitab, et mitmete uuritud pofiibiidide risk on kõrge. Arvestades, et P. gracilis vajab metamorfoosi lõpuleviimiseks ligikaudu 30 päeva56, võib järeldada, et uuritud tsüpermetriini kontsentratsioonid võivad kaasa aidata populatsiooni vähenemisele, takistades nakatunud isikute jõudmist täiskasvanud või paljunemisfaasi varases eas.
Mikrotuumade ja muude erütrotsüütide tuumaanomaaliate arvutatud riskihinnangus jäid CHQ väärtused vahemikku 14,92 kuni 97,00, mis näitab, et tsüpermetriinil oli potentsiaalne genotoksiline risk P. gracilisele isegi selle looduslikus elupaigas. Võttes arvesse suremust, oli P. gracilise suhtes talutavate ksenobiootiliste ühendite maksimaalne kontsentratsioon 4,24 μg L−1. Kuid juba 1 μg/l kontsentratsioonil ilmnes ka genotoksiline toime. See asjaolu võib kaasa tuua ebanormaalsete isendite arvu suurenemise57 ning mõjutada liikide arengut ja paljunemist nende elupaikades, mis viib kahepaiksete populatsioonide vähenemiseni.
Insektitsiid tsüpermetriini kaubanduslikud preparaadid näitasid P. gracilise suhtes suurt ägedat ja kroonilist toksilisust. Täheldati suuremat suremust, mis on tõenäoliselt tingitud toksiliste mõjudest, mida tõendavad mikrotuumade ja erütrotsüütide tuumaanomaaliad, eriti sakilised tuumad, lobed tuumad ja vesikulaarsed tuumad. Lisaks näitasid uuritud liigid suurenenud keskkonnariske, nii ägedaid kui kroonilisi. Need andmed koos meie uurimisrühma varasemate uuringutega näitasid, et isegi erinevad tsüpermetriini kaubanduslikud koostised põhjustasid endiselt atsetüülkoliinesteraasi (AChE) ja butürüülkoliinesteraasi (BChE) aktiivsuse vähenemist ja oksüdatiivset stressi58 ning põhjustasid muutusi ujumisaktiivsuses ja suuõõne väärarenguid59 P. gracilis, mis viitab sellele, et selle müügilolevate müügilolevate letaalsete ja subhaleerivate preparaatide koostises on kõrge toksilisus. Hartmann jt. 60 leidis, et tsüpermetriini kaubanduslikud preparaadid olid P. gracilise ja sama perekonna teise liigi (P. cuvieri) suhtes kõige toksilisemad, võrreldes üheksa teise pestitsiidiga. See viitab sellele, et keskkonnakaitseks seaduslikult heaks kiidetud tsüpermetriini kontsentratsioonid võivad põhjustada suurt suremust ja pikaajalist elanikkonna vähenemist.
Pestitsiidide toksilisuse hindamiseks kahepaiksetele on vaja täiendavaid uuringuid, kuna keskkonnas leiduvad kontsentratsioonid võivad põhjustada suurt suremust ja kujutada endast potentsiaalset ohtu P. gracilisele. Kahepaiksete liikide uurimist tuleks julgustada, kuna andmeid nende organismide, eriti Brasiilia liikide kohta on vähe.
Kroonilise toksilisuse test kestis staatilistes tingimustes 168 tundi (7 päeva) ja subletaalsed kontsentratsioonid olid: 1, 3, 6 ja 20 μg ai L−1. Mõlemas katses hinnati 10 kullest ravirühma kohta kuue kordusega, kokku 60 kullese kontsentratsiooni kohta. Vahepeal toimis ainult veega töötlemine negatiivse kontrollina. Iga katseseade koosnes steriilsest klaasnõust mahuga 500 ml ja tihedusega 1 kulles 50 ml lahuse kohta. Kolb kaeti aurustumise vältimiseks polüetüleenkilega ja seda õhustati pidevalt.
Vett analüüsiti keemiliselt, et määrata pestitsiidide kontsentratsioonid 0, 96 ja 168 tunni pärast. Vastavalt Sabin jt. 68 ja Martins et al. 69, viidi analüüsid läbi Santa Maria föderaalse ülikooli pestitsiidianalüüsi laboris (LARP), kasutades gaasikromatograafiat, mis oli ühendatud kolmekordse kvadrupooli massispektromeetriaga (Varian mudel 1200, Palo Alto, California, USA). Pestitsiidide kvantitatiivne määramine vees on näidatud lisamaterjalina (tabel SM1).
Mikrotuumatesti (MNT) ja punaliblede tuumaanomaalia testi (RNA) jaoks analüüsiti igast ravirühmast 15 kullest. Kullesed anesteseeriti 5% lidokaiiniga (50 mg g-170) ja vereproovid koguti südamepunktsiooniga, kasutades ühekordselt kasutatavaid hepariniseeritud süstlaid. Vereproovid valmistati steriilsetel mikroskoobi alusklaasidel, kuivatati õhu käes, fikseeriti 100% metanooliga (4 °C) 2 minutit ja värviti seejärel 10% Giemsa lahusega 15 minutit pimedas. Protsessi lõpus pesti slaidid destilleeritud veega, et eemaldada liigne plekk ja kuivatati toatemperatuuril.
MN ja ENA olemasolu määramiseks analüüsiti igast kullesest vähemalt 1000 punast vereliblesid 100-kordse mikroskoobiga, mille eesmärk oli 71. Kokku hinnati 75 796 kulleste punast vereliblede arvu, võttes arvesse tsüpermetriini kontsentratsioone ja kontrolle. Genotoksilisust analüüsiti Carrasco et al. ja Fenech et al.38,72, määrates kindlaks järgmiste tuumakahjustuste sageduse: (1) tuumarakud: rakud ilma tuumadeta; (2) apoptootilised rakud: tuuma fragmentatsioon, programmeeritud rakusurm; (3) kahetuumalised rakud: kahe tuumaga rakud; (4) tuumapungad või bleb-rakud: rakud, mille tuumad on tuumamembraani väikeste eenditega, mille suurus on mikrotuumadele sarnane; (5) karüolüüsitud rakud: rakud, millel on ainult tuuma piirjooned ilma sisemise materjalita; (6) sälgulised rakud: rakud, mille tuumad on ilmsete pragude või kujuga sälkudega, mida nimetatakse ka neerukujulisteks tuumadeks; (7) lobuleeritud rakud: rakud, mille tuuma väljaulatuvad osad on suuremad kui eespool nimetatud vesiikulid; ja (8) mikrorakud: kondenseerunud tuumade ja vähendatud tsütoplasmaga rakud. Muutusi võrreldi negatiivse kontrolli tulemustega.
Ägeda toksilisuse testi tulemusi (LC50) analüüsiti GBasic tarkvara ja TSK-Trimmed Spearman-Karberi meetodi abil74. Kroonilise testi andmeid eeltestiti vea normaalsuse (Shapiro-Wilks) ja dispersiooni homogeensuse (Bartlett) suhtes. Tulemusi analüüsiti ühesuunalise dispersioonanalüüsi (ANOVA) abil. Tukey testi kasutati andmete võrdlemiseks omavahel ning Dunnetti testi kasutati andmete võrdlemiseks ravirühma ja negatiivse kontrollrühma vahel.
LOEC ja NOEC andmeid analüüsiti Dunnetti testiga. Statistilised testid viidi läbi tarkvara Statistica 8.0 (StatSoft) abil olulisuse tasemega 95% (p < 0,05).
Postitusaeg: 13. märts 2025