Guizhou provintsis on sademete hooajaline jaotus ebaühtlane, kevadel ja suvel on rohkem sademeid, kuid rapsiseemned on sügisel ja talvel põuastressile vastuvõtlikud, mis mõjutab saagikust tõsiselt. Sinep on spetsiaalne õlikultuur, mida kasvatatakse peamiselt Guizhou provintsis. Sellel on tugev põuataluvus ja seda saab kasvatada mägistes piirkondades. See on rikas põuakindlate geenide poolest. Põuakindlate geenide avastamine on kriitilise tähtsusega sinepisortide täiustamiseks ja iduplasma ressursside uuendamiseks. GRF-perekond mängib olulist rolli taimede kasvus ja arengus ning põuastressile reageerimisel. Praegu on GRF-geene leitud Arabidopsis'elt 2, riisilt (Oryza sativa) 12, rapsiseemnelt 13, puuvillalt (Gossypium hirsutum) 14, nisult (Triticum aestivum) 15, pärlhirssilt (Setaria italica) 16 ja Brassica'lt 17, kuid sinepis GRF-geenide tuvastamise kohta pole teateid. Selles uuringus identifitseeriti sinepi GRF perekonna geenid genoomi tasandil ning analüüsiti nende füüsikalisi ja keemilisi omadusi, evolutsioonilisi seoseid, homoloogiat, konserveerunud motiive, geenistruktuuri, geenide duplikatsioone, cis-elemente ja seemiku staadiumi (neljaleheline staadium). Põua stressi all esinevaid ekspressioonimustreid analüüsiti põhjalikult, et pakkuda teaduslikku alust edasistele uuringutele BjGRF geenide võimaliku funktsiooni kohta põuareaktsioonis ja pakkuda kandidaatgeene põuakindla sinepi aretamiseks.
Brassica juncea genoomis identifitseeriti kahe HMMER-otsingu abil 34 BjGRF geeni, mis kõik sisaldavad QLQ ja WRC domeene. Identifitseeritud BjGRF geenide CDS-järjestused on esitatud lisatabelis S1. BjGRF01–BjGRF34 on nimetatud nende asukoha järgi kromosoomis. Selle perekonna füüsikalis-keemilised omadused näitavad, et aminohappe pikkus on väga varieeruv, ulatudes 261 aminohappest (BjGRF19) kuni 905 aminohappest (BjGRF28). BjGRF isoelektriline punkt jääb vahemikku 6,19 (BjGRF02) kuni 9,35 (BjGRF03), keskmiselt 8,33, ja 88,24% BjGRF-ist on aluseline valk. BjGRF ennustatud molekulmassi vahemik on 29,82 kDa (BjGRF19) kuni 102,90 kDa (BjGRF28); BjGRF valkude ebastabiilsusindeks jääb vahemikku 51,13 (BjGRF08) kuni 78,24 (BjGRF19), kõik on üle 40, mis näitab, et rasvhapete indeks jääb vahemikku 43,65 (BjGRF01) kuni 78,78 (BjGRF22), keskmine hüdrofiilsus (GRAVY) jääb vahemikku -1,07 (BjGRF31) kuni -0,45 (BjGRF22), kõigil hüdrofiilsetel BjGRF valkudel on negatiivsed GRAVY väärtused, mis võib olla tingitud jääkide põhjustatud hüdrofoobsuse puudumisest. Subtsellulaarse lokaliseerimise ennustus näitas, et 31 BjGRF-i kodeeritud valku võis lokaliseeruda tuumas, BjGRF04 võis lokaliseeruda peroksisoomides, BjGRF25 võis lokaliseeruda tsütoplasmas ja BjGRF28 võis lokaliseeruda kloroplastides (tabel 1), mis näitab, et BjGRF-id võivad lokaliseeruda tuumas ja mängida olulist regulatiivset rolli transkriptsioonifaktorina.
Erinevate liikide GRF-perekondade fülogeneetiline analüüs aitab uurida geenide funktsioone. Seetõttu laaditi alla 35 rapsi-, 16 naeri-, 12 riisi-, 10 hirsi- ja 9 Arabidopsis'e GRF-i täispikad aminohappejärjestused ning 34 tuvastatud BjGRF-geeni põhjal koostati fülogeneetiline puu (joonis 1). Kolmel alamperekondal on erinev arv liikmeid; 116 GRF-i TF-i jagunevad kolme erinevasse alamperekonda (rühmad A–C), mis sisaldavad vastavalt 59 (50,86%), 34 (29,31%) ja 23 (19,83)% GRF-idest. Nende hulgas on 34 BjGRF-i perekonna liiget hajutatud 3 alamperekonda: 13 liiget A-rühmas (38,24%), 12 liiget B-rühmas (35,29%) ja 9 liiget C-rühmas (26,47%). Sinepi polüploidiseerumise protsessis on BjGRF-ide geenide arv erinevates alamperekondades erinev ning võis toimuda nii geenide amplifikatsiooni kui ka kadu. Väärib märkimist, et C-rühmas riisi ja hirsi GRF-ide jaotus puudub, samas kui B-rühmas on 2 riisi ja 1 hirsi GRF-i ning enamik riisi ja hirsi GRF-e on rühmitatud ühte harusse, mis näitab, et BjGRF-id on tihedalt seotud kaheidulehtedega. Nende hulgas pakuvad kõige põhjalikumad uuringud GRF-i funktsiooni kohta Arabidopsis thaliana aluse BjGRF-ide funktsionaalsetele uuringutele.
Sinepi fülogeneetiline puu, sealhulgas Brassica napus, Brassica napus, riis, hirss ja Arabidopsis thaliana GRF perekonna liikmed.
Sinepi GRF perekonna korduvate geenide analüüs. Hall joon taustal tähistab sinepi genoomi sünkroniseeritud plokki, punane joon tähistab BjGRF geeni segmenteeritud korduste paari;
BjGRF geeni ekspressioon põua stressi tingimustes neljanda lehe staadiumis. qRT-PCR andmed on esitatud lisatabelis S5. Andmete olulised erinevused on tähistatud väiketähtedega.
Kuna globaalne kliima muutub jätkuvalt, on põllukultuuride põuastressiga toimetuleku ja taluvusmehhanismide parandamise uurimine muutunud kuumaks uurimisteemaks18. Pärast põuda muutuvad taimede morfoloogiline struktuur, geenide ekspressioon ja ainevahetusprotsessid, mis võib viia fotosünteesi lakkamiseni ja ainevahetushäireteni, mõjutades põllukultuuride saagikust ja kvaliteeti19,20,21. Kui taimed tunnetavad põuasignaale, toodavad nad sekundaarseid virgatsaineid, nagu Ca2+ ja fosfatidüülinosiitool, suurendavad rakusisest kaltsiumiioonide kontsentratsiooni ja aktiveerivad valkude fosforüülimise raja regulatiivse võrgustiku22,23. Lõplik sihtvalk osaleb otseselt rakukaitses või reguleerib seotud stressigeenide ekspressiooni transformaatorite kaudu, suurendades taimede stressitaluvust24,25. Seega mängivad transformaatorid põuastressile reageerimisel olulist rolli. Põuastressile reageerivate transformaatorite järjestuse ja DNA sidumisomaduste järgi saab transformaatoreid jagada erinevatesse perekondadesse, näiteks GRF, ERF, MYB, WRKY ja teised perekonnad26.
GRF geeniperekond on taimespetsiifiline transmissioon-transkriptaas, millel on oluline roll erinevates aspektides, nagu kasv, areng, signaaliülekanne ja taime kaitsereaktsioonid27. Pärast esimese GRF geeni tuvastamist O. sativas28 on paljudes liikides tuvastatud üha rohkem GRF geene ja näidatud, et need mõjutavad taime kasvu, arengut ja stressireaktsiooni8, 29, 30, 31, 32. Brassica juncea genoomi järjestuse avaldamisega sai võimalikuks BjGRF geeniperekonna identifitseerimine33. Selles uuringus identifitseeriti kogu sinepi genoomis 34 BjGRF geeni ja nimetati need oma kromosomaalse positsiooni põhjal BjGRF01–BjGRF34. Kõik need sisaldavad kõrgelt konserveerunud QLQ ja WRC domeene. Füüsikalis-keemiliste omaduste analüüs näitas, et BjGRF valkude (välja arvatud BjGRF28) aminohapete arvu ja molekulmasside erinevused ei olnud olulised, mis näitab, et BjGRF perekonna liikmetel võivad olla sarnased funktsioonid. Geenistruktuuri analüüs näitas, et 64,7% BjGRF geenidest sisaldas 4 eksonit, mis näitab, et BjGRF geeni struktuur on evolutsioonis suhteliselt konserveerunud, kuid BjGRF10, BjGRF16, BjGRP28 ja BjGRF29 geenides on eksonite arv suurem. Uuringud on näidanud, et eksonite või intronite lisamine või deletsioon võib põhjustada erinevusi geeni struktuuris ja funktsioonis, luues seeläbi uusi geene34,35,36. Seetõttu oletame, et BjGRF intron kadus evolutsiooni käigus, mis võib põhjustada muutusi geenifunktsioonis. Kooskõlas olemasolevate uuringutega leidsime ka, et intronite arv oli seotud geeniekspressiooniga. Kui geenis on palju introneid, saab geen kiiresti reageerida mitmesugustele ebasoodsatele teguritele.
Geenide dubleerimine on genoomse ja geneetilise evolutsiooni peamine tegur37. Seotud uuringud on näidanud, et geenide dubleerimine mitte ainult ei suurenda GRF-geenide arvu, vaid toimib ka vahendina uute geenide genereerimiseks, mis aitavad taimedel kohaneda erinevate ebasoodsate keskkonnatingimustega38. Selles uuringus leiti kokku 48 dubleeritud geenipaari, mis kõik olid segmentaalsed duplikatsioonid, mis näitab, et segmentaalsed duplikatsioonid on selle perekonna geenide arvu suurendamise peamine mehhanism. Kirjanduses on teatatud, et segmentaalne dubleerimine võib tõhusalt soodustada GRF-geeniperekonna liikmete amplifikatsiooni Arabidopsis'es ja maasikas ning selle geeniperekonna tandemduplikatsiooni ei leitud üheski liigis27,39. Selle uuringu tulemused on kooskõlas olemasolevate uuringutega Arabidopsis thaliana ja maasikate perekondade kohta, mis viitab sellele, et GRF-perekond võib suurendada geenide arvu ja genereerida uusi geene segmentaalse dubleerimise kaudu erinevates taimedes.
Selles uuringus identifitseeriti sinepis kokku 34 BjGRF geeni, mis jagati kolme alamperekonda. Need geenid näitasid sarnaseid konserveerunud motiive ja geenistruktuure. Kollineaarsuse analüüs näitas sinepis 48 paari segmendi duplikatsioone. BjGRF promootori piirkond sisaldab cis-toimelisi elemente, mis on seotud valgusreaktsiooni, hormonaalse reaktsiooni, keskkonnastressi reaktsiooni ning kasvu ja arenguga. Sinepi seemiku staadiumis (juured, varred, lehed) tuvastati 34 BjGRF geeni ekspressioon ja 10 BjGRF geeni ekspressioonimuster põua tingimustes. Leiti, et BjGRF geenide ekspressioonimustrid põua ajal olid sarnased ja võivad olla sarnased. BjGRF03 ja BjGRF32 geenid võivad põuastressi korral mängida positiivset regulatiivset rolli, samas kui BjGRF06 ja BjGRF23 mängivad põuastressi korral rolli miR396 sihtgeenidena. Üldiselt pakub meie uuring bioloogilise aluse BjGRF geeni funktsiooni edasiseks avastamiseks ristõieliste taimedes.
Selles katses kasutatud sinepiseemned saadi Guizhou õliseemnete uurimisinstituudist, Guizhou Põllumajandusteaduste Akadeemiast. Valige terved seemned ja istutage need mulda (substraat:muld = 3:1) ning koguge juured, varred ja lehed pärast neljalehelist staadiumi. Taimi töödeldi põua simuleerimiseks 20% PEG 6000-ga ning lehed koguti 0, 3, 6, 12 ja 24 tunni pärast. Kõik taimeproovid külmutati kohe vedelas lämmastikus ja seejärel säilitati -80 °C sügavkülmikus järgmise testi jaoks.
Kõik selle uuringu käigus saadud või analüüsitud andmed on avaldatud artiklis ja lisateabe failides.
Postituse aeg: 22. jaanuar 2025