Männinematood on karantiinis rändav endoparasiit, mis teadaolevalt põhjustab männimetsa ökosüsteemides tõsist majanduslikku kahju. Käesolev uuring annab ülevaate halogeenitud indoolide nematotsiidsest aktiivsusest männinematoodide vastu ja nende toimemehhanismist. 5-jodoindooli ja avermektiini (positiivne kontroll) nematotsiidne toime männinematoodide vastu oli sarnane ja madalate kontsentratsioonide (10 μg/ml) korral kõrge. 5-jodoindool vähendas viljakust, reproduktiivset aktiivsust, embrüonaalset ja vastsete suremust ning lokomotoorset käitumist. Ligandide molekulaarsed interaktsioonid selgrootute spetsiifiliste glutamaadiga seotud kloriidikanali retseptoritega toetavad arusaama, et 5-jodoindool seondub sarnaselt avermektiiniga tihedalt retseptori aktiivse saidiga. 5-jodoindool indutseeris nematoodides ka mitmesuguseid fenotüübilisi deformatsioone, sealhulgas ebanormaalset organite kokkuvarisemist/kahanemist ja suurenenud vakuolisatsiooni. Need tulemused viitavad sellele, et vakuoolid võivad mängida rolli nematoodide metülatsiooni vahendatud surmas. Oluline on see, et 5-jodoindool ei olnud mürgine mõlemale taimeliigile (kapsas ja redis). Seega näitab see uuring, et jodoindooli manustamine keskkonnatingimustes suudab männi närbumiskahjustusi kontrolli all hoida.
Männipuidu nematood (Bursaphelenchus xylophilus) kuulub männipuidu nematoodide (PWN) hulka, mis on rändavad endoparasiitsed nematoodid, mis teadaolevalt põhjustavad männimetsa ökosüsteemidele tõsist ökoloogilist kahju1. Männipuidu nematoodi põhjustatud männi närbumishaigus on muutumas tõsiseks probleemiks mitmel kontinendil, sealhulgas Aasias ja Euroopas, ning Põhja-Ameerikas hävitab nematood sissetoodud männiliike1,2. Männipuude hääbumine on suur majanduslik probleem ja selle globaalse leviku väljavaade on murettekitav3. Järgmisi männiliike ründab nematood kõige sagedamini: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii ja Pinus radiata4. Männinematood on tõsine haigus, mis võib tappa männipuud nädalate või kuude jooksul pärast nakatumist. Lisaks on männinematoodide puhangud levinud erinevates ökosüsteemides, seega on tekkinud püsivad nakkusahelad1.
Bursaphelenchus xylophilus on karantiinne taimeparasiitne nematood, mis kuulub ülemsugukonda Aphelenchoidea ja klaadi 102.5. Nematood toitub seentest ja paljuneb männipuude puitkudedes, arenedes neljaks erinevaks vastse staadiumiks: L1, L2, L3, L4 ja täiskasvanud isendiks1,6. Toidupuuduse tingimustes läheb männinematood spetsialiseerunud vastse staadiumisse – dauer, mis parasiteerib oma vektoril – männi-kooremardikal (Monochamus alternatus) – ja kandub üle tervetele männipuudele. Tervetel peremeesorganismidel rändavad nematoodid kiiresti läbi taimekudede ja toituvad parenhüümirakkudest, mis põhjustab mitmeid ülitundlikkusreaktsioone, männi närbumist ja surma aasta jooksul pärast nakatumist1,7,8.
Männi nematoodide bioloogiline tõrje on pikka aega olnud väljakutse ning karantiinimeetmed pärinevad 20. sajandist. Praegused männi nematoodide tõrje strateegiad hõlmavad peamiselt keemilist töötlemist, sealhulgas puidu fumigatsiooni ja nematotsiidide implanteerimist puutüvedesse. Kõige sagedamini kasutatavad nematotsiidid on avermektiin ja avermektiinbensoaat, mis kuuluvad avermektiinide perekonda. Need kallid kemikaalid on paljude nematoodiliikide vastu väga tõhusad ja neid peetakse keskkonnasõbralikuks9. Nende nematotsiidide korduv kasutamine peaks aga tekitama selektsioonisurve, mis peaaegu kindlasti viib resistentsete männi nematoodide tekkeni, nagu on näidatud mitmete putukakahjurite puhul, näiteks Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella ja nematoodide Trichostrongylus colubriformis ja Ostertagia circumcincta puhul, mis on järk-järgult arendanud välja resistentsuse avermektiinide suhtes10,11,12. Seetõttu tuleb resistentsusmustreid regulaarselt uurida ja nematotsiide pidevalt skriinida, et leida alternatiivseid, kulutõhusaid ja keskkonnasõbralikke meetmeid PVD tõrjeks. Viimastel aastakümnetel on mitmed autorid pakkunud välja taimeekstraktide, eeterlike õlide ja lenduvate ainete kasutamise nematoodide tõrjevahenditena13,14,15,16.
Hiljuti demonstreerisime indooli, rakkudevahelise ja kuningriikidevahelise signaalimolekuli, nematotsiidset aktiivsust Caenorhabditis elegans'il 17. Indool on mikroobide ökoloogias laialt levinud rakusisene signaalmolekul, mis kontrollib arvukalt funktsioone, mis mõjutavad mikroobide füsioloogiat, eoste moodustumist, plasmiidi stabiilsust, ravimiresistentsust, biokile moodustumist ja virulentsust 18, 19. Indooli ja selle derivaatide aktiivsust teiste patogeensete nematoodide vastu ei ole uuritud. Selles uuringus uurisime 34 indooli nematotsiidset aktiivsust männi nematoodide vastu ja selgitasime välja kõige tugevama 5-jodoindooli toimemehhanismi mikroskoopia, aeglustatud fotograafia ja molekulaarsete dokkimiskatsete abil ning hindasime selle toksilist mõju taimedele seemnete idanemistesti abil.
Varem on teatatud, et indooli kõrged kontsentratsioonid (>1,0 mM) omavad nematoodidele nematoodidevastast toimet17. Pärast B. xylophilus'e (segatud eluetapid) töötlemist indooli või 33 erineva indooli derivaadiga kontsentratsioonis 1 mM mõõdeti B. xylophilus'e suremust, loendades elusaid ja surnud nematoodid kontroll- ja töödeldud rühmas. Viiel indoolil oli märkimisväärne nematoodidevastane toime; töötlemata kontrollrühma elulemus oli 24 tunni pärast 95 ± 7%. 34 testitud indoolist põhjustasid 5-jodoindool ja 4-fluoroindool kontsentratsioonis 1 mM 100% suremuse, samas kui 5,6-difluoroindigo, metüülindool-7-karboksülaat ja 7-jodoindool põhjustasid ligikaudu 50% suremuse (tabel 1).
5-jodoindooli mõju männipuidust nematoodi vakuoolide moodustumisele ja metabolismile. (A) Avermektiini ja 5-jodoindooli mõju täiskasvanud isasnematoodidele, (B) L1 staadiumi nematoodide munad ja (C) B. xylophilus metabolism, (i) vakuoole ei täheldatud 0 tunni möödudes, töötlemine põhjustas (ii) vakuoolide teket, (iii) mitmete vakuoolide akumuleerumist, (iv) vakuoolide paisumist, (v) vakuoolide fusiooni ja (vi) hiiglaslike vakuoolide moodustumist. Punased nooled näitavad vakuoolide paisumist, sinised nooled näitavad vakuoolide fusiooni ja mustad nooled näitavad hiiglaslikke vakuoole. Skaalariba = 50 μm.
Lisaks kirjeldas see uuring ka metaani poolt indutseeritud surma järjestikust protsessi männi nematoodides (joonis 4C). Metanogeenne surm on mitteapoptootiline rakusurma tüüp, mis on seotud silmapaistvate tsütoplasmaatiliste vakuoolide akumuleerumisega27. Männi nematoodides täheldatud morfoloogilised defektid näivad olevat tihedalt seotud metaani poolt indutseeritud surma mehhanismiga. Erinevatel aegadel tehtud mikroskoopiline uuring näitas, et hiiglaslikud vakuoolid tekkisid pärast 20-tunnist kokkupuudet 5-jodoindooliga (0,1 mM). Mikroskoopilisi vakuoole täheldati pärast 8-tunnist töötlemist ja nende arv suurenes 12 tunni pärast. 14 tunni pärast täheldati mitmeid suuri vakuoole. 12–16-tunnise töötlemise järel oli mitu sulandunud vakuooli selgelt nähtav, mis näitab, et vakuoolide sulandumine on metanogeense surma mehhanismi alus. 20 tunni pärast leiti kogu ussist mitu hiiglaslikku vakuooli. Need tähelepanekud on esimene aruanne metooosi kohta C. elegans'il.
5-jodoindooliga töödeldud ussidel täheldati ka vakuoolide agregatsiooni ja rebenemist (joonis 5), mida tõendab usside painutamine ja vakuoolide vabanemine keskkonda. Vakuoolide purunemist täheldati ka munakoore membraanis, mida L2 tavaliselt koorumise ajal puutumatuna säilitab (lisajoonis S2). Need tähelepanekud toetavad vedeliku kogunemise ja osmoregulatoorse häire, samuti pöörduva rakukahjustuse (RCI) osalemist vakuoolide moodustumise ja suppuratsiooni protsessis (joonis 5).
Hüpoteesides joodi rolli täheldatud vakuoolide moodustumisel, uurisime naatriumjodiidi (NaI) ja kaaliumjodiidi (KI) nematotsiidset aktiivsust. Kontsentratsioonidel (0,1, 0,5 või 1 mM) ei mõjutanud need aga nematoodide ellujäämist ega vakuoolide moodustumist (lisajoonis S5), kuigi 1 mM KI-l oli kerge nematotsiidne toime. Teisest küljest indutseeris 7-jodoindool (1 või 2 mM), nagu ka 5-jodoindool, mitmeid vakuoole ja struktuurilisi deformatsioone (lisajoonis S6). Mõlemad jodoindoolid näitasid männi nematoodidel sarnaseid fenotüübilisi omadusi, samas kui NaI ja KI seda ei teinud. Huvitaval kombel ei indutseerinud indool testitud kontsentratsioonidel vakuoolide moodustumist B. xylophilus'el (andmeid pole esitatud). Seega kinnitasid tulemused, et indool-joodi kompleks vastutab B. xylophilus'e vakuolisatsiooni ja metabolismi eest.
Nematotsiidse aktiivsuse suhtes testitud indoolide seas oli 5-jodoindoolil kõrgeim libisemisindeks -5,89 kcal/mol, millele järgnesid 7-jodoindool (-4,48 kcal/mol), 4-fluoroindool (-4,33) ja indool (-4,03) (joonis 6). 5-jodoindooli tugev vesinikside leutsiiniga 218 stabiliseerib selle seondumist, samas kui kõik teised indooli derivaadid seonduvad seriiniga 260 külgahela vesiniksidemete kaudu. Teiste modelleeritud jodoindoolide hulgas on 2-jodoindooli seondumisväärtus -5,248 kcal/mol, mis on tingitud selle peamisest vesiniksidemest leutsiiniga 218. Teiste teadaolevate seondumiste hulka kuuluvad 3-jodoindool (-4,3 kcal/mol), 4-jodoindool (-4,0 kcal/mol) ja 6-fluoroindool (-2,6 kcal/mol) (lisajoonis S8). Enamik halogeenitud indoole ja indool ise, välja arvatud 5-jodoindool ja 2-jodoindool, moodustavad sideme seriiniga 260. Asjaolu, et vesinikside leutsiiniga 218 viitab efektiivsele retseptor-ligandi sidumisele, nagu on täheldatud ivermektiini puhul (lisajoonis S7), kinnitab, et 5-jodoindool ja 2-jodoindool, nagu ivermektiin, seonduvad tihedalt GluCL retseptori aktiivse tsentriga leutsiin 218 kaudu (joonis 6 ja lisjoonis S8). Pakume välja, et see seondumine on vajalik GluCL kompleksi avatud pooride struktuuri säilitamiseks ning et GluCL retseptori aktiivse tsentriga tihedalt seondudes hoiavad 5-jodoindool, 2-jodoindool, avermektiin ja ivermektiin ioonkanali avatuna ja võimaldavad vedeliku omastamist.
Indooli ja halogeenitud indooli molekulaarne dokkimine GluCL-iga. (A) indooli, (B) 4-fluoroindooli, (C) 7-jodoindooli ja (D) 5-jodoindooli ligandide seondumisorientatsioonid GluCL-i aktiivsele kohale. Valku kujutab lint ja selgroo vesiniksidemed on näidatud kollaste punktiirjoontega. (A'), (B'), (C') ja (D') näitavad vastavate ligandide interaktsioone ümbritsevate aminohappejääkidega ja külgahela vesiniksidemed on näidatud roosade punktiirnooltega.
Katseid tehti 5-jodoindooli toksilise mõju hindamiseks kapsa- ja rediseseemnete idanemisele. 5-jodoindoolil (0,05 või 0,1 mM) või avermektiinil (10 μg/ml) oli vähene või puudub igasugune mõju esialgsele idanemisele ja taimede tärkamisele (joonis 7). Lisaks ei leitud olulist erinevust töötlemata kontrollproovide ja 5-jodoindooli või avermektiiniga töödeldud seemnete idanemiskiiruse vahel. Mõju kõrrejuurte pikenemisele ja moodustunud külgjuurte arvule oli ebaoluline, kuigi 1 mM (10 korda suurem kui selle aktiivne kontsentratsioon) 5-jodoindooli aeglustas külgjuurte arengut veidi. Need tulemused näitavad, et 5-jodoindool ei ole taimerakkudele toksiline ega häiri uuritud kontsentratsioonides taimede arenguprotsesse.
5-jodoindooli mõju seemnete idanemisele. B. oleracea ja R. raphanistrum seemnete idanemine, võrsumine ja külgmine juurdumine Murashige ja Skoogi agaril, mis sisaldas või ei sisaldanud avermektiini või 5-jodoindooli. Idanemist registreeriti pärast 3-päevast inkubeerimist temperatuuril 22 °C.
See uuring kirjeldab mitmeid nematoodide hävitamise juhtumeid indoolide abil. Oluline on see, et see on esimene aruanne jodoindooli indutseerivast metülatsioonist (protsess, mille põhjustab väikeste vakuoolide kogunemine, mis järk-järgult sulanduvad hiiglaslikeks vakuoolideks, mis lõpuks viib membraani purunemise ja surmani) männiokastes, kusjuures jodoindoolil on märkimisväärsed nematotsiidsed omadused, mis sarnanevad kaubandusliku nematitsiidi avermektiini omadustega.
Varem on teatatud, et indoolidel on prokarüootides ja eukarüootides mitu signaaliülekande funktsiooni, sealhulgas biokile pärssimine/moodustamine, bakterite ellujäämine ja patogeensus19,32,33,34. Hiljuti on halogeenitud indoolide, indoolalkaloidide ja poolsünteetiliste indooli derivaatide potentsiaalne terapeutiline toime äratanud laialdast uurimishuvi35,36,37. Näiteks on näidatud, et halogeenitud indoolid hävitavad püsivaid Escherichia coli ja Staphylococcus aureus rakke37. Lisaks on teaduslikult huvipakkuv uurida halogeenitud indoolide efektiivsust teiste liikide, perekondade ja kuningriikide vastu ning see uuring on samm selle eesmärgi saavutamise suunas.
Siin pakume välja mehhanismi 5-jodoindooli poolt indutseeritud letaalsuse tekkeks C. elegans'is, mis põhineb pöörduval rakukahjustusel (RCI) ja metülatsioonil (joonised 4C ja 5). Turse muutused, nagu turse ja vakuoolide degeneratsioon, on RCI ja metülatsiooni näitajad, mis avalduvad hiiglaslike vakuoolidena tsütoplasmas48,49. RCI häirib energia tootmist, vähendades ATP tootmist, põhjustades ATPaasi pumba rikke või lõhustades rakumembraane ja põhjustades Na+, Ca2+ ja vee kiire sissevoolu50,51,52. Intratsütoplasmaatilised vakuoolid tekivad loomarakkudes vedeliku kogunemise tagajärjel tsütoplasmas Ca2+ ja vee sissevoolu tõttu53. Huvitaval kombel on see rakkude kahjustuse mehhanism pöörduv, kui kahjustus on ajutine ja rakud hakkavad teatud aja jooksul ATP-d tootma, kuid kui kahjustus püsib või süveneb, siis rakud surevad.54 Meie tähelepanekud näitavad, et 5-jodoindooliga töödeldud nematoodid ei suuda pärast stressitingimustele kokkupuudet normaalset biosünteesi taastada.
5-jodoindooli poolt B. xylophilus'el indutseeritud metülatsioonifenotüüp võib olla tingitud joodi olemasolust ja selle molekulaarsest jaotumisest, kuna 7-jodoindoolil oli B. xylophilus'ele väiksem inhibeeriv toime kui 5-jodoindoolil (tabel 1 ja lisajoonis S6). Need tulemused on osaliselt kooskõlas Maltese jt (2014) uuringutega, kes teatasid, et püridüüllämmastiku osa translokatsioon indoolis para-positsioonist meta-positsiooni kaotas vakuolisatsiooni, kasvu pärssimise ja tsütotoksilisuse U251 rakkudes, mis viitab sellele, et molekuli interaktsioon valgu spetsiifilise aktiivse saidiga on kriitilise tähtsusega27,44,45. Selles uuringus täheldatud indooli või halogeenitud indoolide ja GluCL-retseptorite vahelised interaktsioonid toetavad seda arusaama, kuna leiti, et 5- ja 2-jodoindool seonduvad GluCL-retseptoritega tugevamalt kui teised uuritud indoolid (joonis 6 ja lisajoonis S8). Indooli teises või viiendas positsioonis olev jood seondub GluCL retseptori leutsiiniga 218 vesiniksidemete kaudu, samas kui teised halogeenitud indoolid ja indool ise moodustavad nõrku külgahela vesiniksidemeid seriiniga 260 (joonis 6). Seetõttu oletame, et halogeeni lokaliseerumine mängib olulist rolli vakuoolide degeneratsiooni indutseerimisel, samas kui 5-jodoindooli tihe seondumine hoiab ioonkanali avatuna, võimaldades seeläbi kiiret vedeliku sissevoolu ja vakuoolide purunemist. 5-jodoindooli üksikasjalik toimemehhanism on aga veel määramata.
Enne 5-jodoindooli praktilist kasutamist tuleks analüüsida selle toksilist mõju taimedele. Meie seemnete idandamise katsed näitasid, et 5-jodoindoolil ei olnud uuritud kontsentratsioonides negatiivset mõju seemnete idanemisele ega järgnevatele arenguprotsessidele (joonis 7). Seega annab see uuring aluse 5-jodoindooli kasutamiseks ökoloogilises keskkonnas männi nematoodide kahjulikkuse kontrollimiseks männipuudele.
Varasemad uuringud on näidanud, et indoolipõhine ravi kujutab endast potentsiaalset lähenemisviisi antibiootikumiresistentsuse ja vähi progresseerumise probleemi lahendamiseks55. Lisaks on indoolidel antibakteriaalne, vähivastane, antioksüdantne, põletikuvastane, diabeedivastane, viirusevastane, proliferatsioonivastane ja tuberkuloosivastane toime ning need võivad olla paljulubavaks aluseks ravimite väljatöötamisel56,57. See uuring pakub esmakordselt välja joodi võimaliku kasutamise parasiidivastase ja anthelmintikumina.
Avermektiin avastati kolm aastakümmet tagasi ja võitis Nobeli preemia 2015. aastal ning selle kasutamine anthelmintikumina on endiselt aktiivne. Kuna aga nematoodidel ja putukakahjuritel on avermektiinide resistentsuse kiire areng, on männipuude männi nematoodide nakkuse tõrjeks vaja alternatiivset, odavat ja keskkonnasõbralikku strateegiat. Käesolev uuring kirjeldab ka mehhanismi, mille abil 5-jodoindool hävitab männi nematoode, ning et 5-jodoindoolil on taimerakkudele madal toksilisus, mis avab head väljavaated selle tulevaseks kaubanduslikuks rakendamiseks.
Kõik katsed kiitis heaks Yeungnami ülikooli eetikakomitee Gyeongsanis Koreas ja meetodid viidi läbi vastavalt Yeungnami ülikooli eetikakomitee suunistele.
Munade inkubeerimiskatsed viidi läbi väljakujunenud protseduuride43 abil. Koorumiskiiruse (HR) hindamiseks viidi 1-päevased täiskasvanud nematoodid (umbes 100 emast ja 100 isast) seent sisaldavatesse Petri tassidesse ja lasti 24 tundi kasvada. Seejärel munad isoleeriti ja töödeldi 5-jodoindooliga (0,05 mM ja 0,1 mM) või avermektiiniga (10 μg/ml) suspensioonina steriilses destilleeritud vees. Need suspensioonid (500 μl; ligikaudu 100 muna) viidi 24-süvendilise koekultuuriplaadi süvenditesse ja inkubeeriti temperatuuril 22 °C. L2 loendati pärast 24-tunnist inkubeerimist, kuid neid peeti surnuteks, kui rakud ei liikunud peene plaatinatraadiga stimuleerimisel. See katse viidi läbi kahes etapis, igas etapis kuus kordust. Mõlema katse andmed ühendati ja esitati. HR protsent arvutatakse järgmiselt:
Vastsete suremust hinnati eelnevalt väljatöötatud protseduuride abil. Nematoodide munad koguti ja embrüod sünkroniseeriti koorumise teel steriilses destilleeritud vees, et saada L2-staadiumis vastsed. Sünkroniseeritud vastseid (umbes 500 nematoodi) töödeldi 5-jodoindooliga (0,05 mM ja 0,1 mM) või avermektiiniga (10 μg/ml) ja kasvatati B. cinerea Petri tassidel. Pärast 48-tunnist inkubeerimist temperatuuril 22 °C koguti nematoodid steriilsesse destilleeritud vette ja uuriti L2-, L3- ja L4-staadiumite olemasolu. L3- ja L4-staadiumite olemasolu viitas vastse transformatsioonile, samas kui L2-staadiumite olemasolu ei näidanud transformatsiooni. Kujutised saadi iRiS™ digitaalse rakkude kuvamise süsteemi abil. See katse viidi läbi kahes etapis, millest igaüks sisaldas kuut kordust. Mõlema katse andmed ühendati ja esitati.
5-jodoindooli ja avermektiini toksilisust seemnetele hinnati idanemistestide abil Murashige ja Skoogi agarplaatidel.62 B. oleracea ja R. raphanistrum seemneid leotati esmalt üks päev steriilses destilleeritud vees, pesti 1 ml 100% etanooliga, steriliseeriti 1 ml 50% kaubandusliku valgendiga (3% naatriumhüpoklorit) 15 minutit ja pesti viis korda 1 ml steriilse veega. Seejärel pressiti steriliseeritud seemned idanemisagarplaatidele, mis sisaldasid 0,86 g/l (0,2X) Murashige ja Skoogi söödet ning 0,7% bakterioloogilist agarit koos 5-jodoindooli või avermektiiniga või ilma. Seejärel inkubeeriti plaate temperatuuril 22 °C ja pildid tehti pärast 3-päevast inkubeerimist. See katse viidi läbi kahes etapis, millest igaühel oli kuus kordust.
Postituse aeg: 26. veebruar 2025