Männinematood on karantiini rändav endoparasiit, mis teadaolevalt põhjustab männimetsa ökosüsteemides tõsist majanduslikku kahju. Käesolevas uuringus vaadeldakse halogeenitud indoolide nematitsiidset toimet männi nematoodide vastu ja nende toimemehhanismi. 5-jodoindooli ja avermektiini (positiivne kontroll) nematitsiidne toime männi nematoodide vastu oli sarnane ja kõrge madalatel kontsentratsioonidel (10 μg/ml). 5-jodoindool vähendas viljakust, reproduktiivset aktiivsust, embrüo ja vastse suremust ning lokomotoorset käitumist. Ligandide molekulaarsed interaktsioonid selgrootute spetsiifiliste glutamaadiga seotud kloriidikanali retseptoritega toetavad arvamust, et 5-jodoindool, nagu avermektiin, seondub tihedalt retseptori aktiivse saidiga. 5-jodoindool indutseeris ka nematoodides mitmesuguseid fenotüüpseid deformatsioone, sealhulgas ebanormaalset elundi kollapsit / kokkutõmbumist ja suurenenud vakuolisatsiooni. Need tulemused viitavad sellele, et vakuoolid võivad mängida rolli nematoodide metüülimise poolt vahendatud surmas. Oluline on see, et 5-jodoindool ei olnud toksiline mõlemale taimeliigile (kapsas ja redis). Seega näitab see uuring, et jodoindooli kasutamine keskkonnatingimustes võib kontrollida männi närbumiskahjustusi.
Männi nematoodid (Bursaphelenchus xylophilus) kuuluvad männi nematoodidesse (PWN), rändavatesse endoparasiitsetesse nematoodidesse, mis teadaolevalt põhjustavad männimetsa ökosüsteemidele tõsist ökoloogilist kahju1. Männi nematoodi põhjustatud männi närbumistõbi (PWD) on muutumas tõsiseks probleemiks mitmel kontinendil, sealhulgas Aasias ja Euroopas, ning Põhja-Ameerikas hävitab nematoodi sissetoodud männiliike1,2. Männipuude vähenemine on suur majanduslik probleem ja selle ülemaailmse leviku väljavaade on murettekitav3. Nematoodid ründavad kõige sagedamini järgmisi männiliike: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii ja Pinus radiata4. Männi nematood on tõsine haigus, mis võib männipuid tappa nädalate või kuude jooksul pärast nakatumist. Lisaks on männi nematoodide puhangud levinud erinevates ökosüsteemides, mistõttu on välja kujunenud püsivad nakkusahelad1.
Bursaphelenchus xylophilus on karantiinitaim-parasiitnematood, mis kuulub ülemperekonda Aphelenchoidea ja klade 102.5. Udususs toitub seentest ja paljuneb männipuude puitkudedes, arenedes neljaks erinevaks vastsefaasiks: L1, L2, L3, L4 ja täiskasvanud isend1,6. Toidupuuduse tingimustes läheb männi nematood spetsialiseeritud vastsete staadiumisse – dauer, mis parasiteerib oma vektoris – männi-kooreüraskul (Monochamus alternatus) ja kandub üle tervetele männipuudele. Tervetel peremeestel rändavad nematoodid kiiresti läbi taimekudede ja toituvad parenhümatoossetest rakkudest, mis põhjustab mitmeid ülitundlikkusreaktsioone, männi närbumist ja surma aasta jooksul pärast nakatumist1,7,8.
Männi nematoodide bioloogiline tõrje on olnud pikka aega väljakutse – karantiinimeetmed ulatuvad 20. sajandisse. Praegused männi nematoodide tõrjestrateegiad hõlmavad peamiselt keemilist töötlemist, sealhulgas puidu fumigeerimist ja nematiidide implanteerimist puutüvedesse. Kõige sagedamini kasutatavad nematiidid on avermektiin ja avermektiinbensoaat, mis kuuluvad avermektiinide perekonda. Need kallid kemikaalid on väga tõhusad paljude nematoodiliikide vastu ja neid peetakse keskkonnaohutuks9. Nende nematiidide korduv kasutamine loob aga selektsioonisurve, mis peaaegu kindlasti viib resistentsete männi nematoodide tekkeni, nagu on tõestatud mitmete putukakahjurite puhul, nagu Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella ja nematoodid Trichostrongylus colubriformis ja Ostertagia circumcincta, mis on järk-järgult välja arendanud resistentsuse 10,10 vastu. Seetõttu tuleb resistentsuse mustreid regulaarselt uurida ja nematitsiide pidevalt sõeluda, et leida alternatiivseid, kulutõhusaid ja keskkonnasõbralikke meetmeid PVD kontrollimiseks. Viimastel aastakümnetel on mitmed autorid teinud ettepaneku kasutada taimeekstrakte, eeterlikke õlisid ja lenduvaid aineid nematoodide tõrjevahenditena13,14,15,16.
Hiljuti demonstreerisime Caenorhabditis elegansis 17 indooli, rakkudevahelise ja kuningriikidevahelise signaalimolekuli, nematitsiidset toimet. Indool on mikroobide ökoloogias laialt levinud rakusisene signaal, mis kontrollib paljusid funktsioone, mis mõjutavad mikroobide füsioloogiat, spooride moodustumist, plasmiidi stabiilsust, ravimiresistentsust, biokile moodustumist ja virulentsust18, 19. Indooli ja selle derivaatide aktiivsust teiste patogeensete nematoodide suhtes ei ole uuritud. Selles uuringus uurisime 34 indooli nematitsiidset toimet männi nematoodide vastu ja selgitasime kõige tugevama 5-jodoindooli toimemehhanismi mikroskoopia, aeglustatud fotograafia ja molekulaarse dokkimise katsete abil ning hindasime selle toksilist mõju taimedele, kasutades seemnete idanemise testi.
Varem on teatatud, et indooli kõrgetel kontsentratsioonidel (> 1, 0 mM) on nematiididele nematitsiidne toime17. Pärast B. xylophiluse (sega eluetapid) töötlemist indooli või 33 erineva indooli derivaadiga kontsentratsioonis 1 mM mõõdeti B. xylophiluse suremust, loendades kontroll- ja ravirühmades elusaid ja surnud nematoodisid. Viiel indoolil oli märkimisväärne nematitsiidne toime; ravimata kontrollrühma elulemus oli 24 tunni pärast 95 ± 7%. 34 testitud indoolist põhjustasid 1 mM 5-jodoindool ja 4-fluoroindool 100% suremuse, samas kui 5,6-difluoroindigo, metüülindool-7-karboksülaat ja 7-jodoindool põhjustasid ligikaudu 50% suremuse (tabel 1).
5-jodoindooli mõju männi nematoodi vakuoolide moodustumisele ja metabolismile. (A) Avermektiini ja 5-jodoindooli mõju täiskasvanud isastele nematoodidele, (B) L1 staadiumis nematoodimunadele ja (C) B. xylophiluse metabolismile, (i) vakuoole ei täheldatud 0 tunni pärast, ravi tulemuseks olid (ii) vakuoolid, (iii) vakuoolide kuhjumine, (iv) vakuoolide paistetus, (iv) vaakum. vakuoolid ja (vi) hiiglaslike vakuoolide teke. Punased nooled näitavad vakuoolide turset, sinised nooled näitavad vakuoolide sulandumist ja mustad nooled näitavad hiiglaslikke vakuoole. Skaalariba = 50 μm.
Lisaks kirjeldas see uuring ka männi nematoodide metaani põhjustatud surma järjestikust protsessi (joonis 4C). Metanogeenne surm on mitte-apoptootiline rakusurma tüüp, mis on seotud silmapaistvate tsütoplasmaatiliste vakuoolide akumuleerumisega27. Männi nematoodidel täheldatud morfoloogilised defektid näivad olevat tihedalt seotud metaanist põhjustatud surma mehhanismiga. Mikroskoopiline uurimine erinevatel aegadel näitas, et pärast 20-tunnist kokkupuudet 5-jodoindooliga (0, 1 mM) tekkisid hiiglaslikud vakuoolid. Mikroskoopilisi vakuoole täheldati pärast 8-tunnist ravi ja nende arv suurenes 12 tunni pärast. 14 tunni pärast täheldati mitmeid suuri vakuoole. Mitmed sulandunud vakuoolid olid pärast 12–16-tunnist ravi selgelt nähtavad, mis näitab, et vakuoolide liitmine on metanogeense surmamehhanismi aluseks. 20 tunni pärast leiti kogu ussist mitu hiiglaslikku vakuooli. Need tähelepanekud esindavad esimest aruannet metuoosi kohta C. elegans'is.
5-jodoindooliga töödeldud usside puhul täheldati ka vakuoolide agregatsiooni ja rebenemist (joonis 5), mida tõendab usside paindumine ja vakuoolide keskkonda sattumine. Vakuoolide katkemist täheldati ka munakoore membraanis, mida L2 säilitab tavaliselt koorumise ajal puutumatuna (täiendav joonis S2). Need tähelepanekud toetavad vedeliku kogunemise ja osmoregulatoorsete häirete, samuti pöörduva rakukahjustuse (RCI) kaasamist vakuoolide moodustumise ja mädanemise protsessi (joonis 5).
Hüpoteesides joodi rolli vaadeldud vakuoolide moodustumisel, uurisime naatriumjodiidi (NaI) ja kaaliumjodiidi (KI) nematitsiidset toimet. Kuid kontsentratsioonidel (0, 1, 0, 5 või 1 mM) ei mõjutanud need nematoodide ellujäämist ega vakuoolide moodustumist (täiendav joonis S5), kuigi 1 mM KI-l oli kerge nematitsiidne toime. Teisest küljest kutsus 7-jodoindool (1 või 2 mM), nagu ka 5-jodoindool, mitu vakuooli ja struktuurseid deformatsioone (täiendav joonis S6). Kahel jodoindoolil oli männi nematoodidel sarnased fenotüübilised omadused, samas kui NaI ja KI mitte. Huvitaval kombel ei kutsunud indool testitud kontsentratsioonidel esile vakuoolide moodustumist B. xylophiluses (andmeid pole näidatud). Seega kinnitasid tulemused, et indool-joodi kompleks vastutab B. xylophiluse vakuoliseerumise ja metabolismi eest.
Nematitsiidse toime suhtes testitud indoolide hulgas oli 5-jodoindoolil suurim libisemisindeks -5,89 kcal/mol, järgnesid 7-jodoindool (-4,48 kcal/mol), 4-fluoroindool (-4,33) ja indool (-4,03) (joonis 6). 5-jodoindooli tugev karkassi vesiniksideme leutsiiniga 218 stabiliseerib selle seondumist, samas kui kõik teised indooli derivaadid seonduvad seriiniga 260 külgahela vesiniksidemete kaudu. Teiste modelleeritud jodoindoolide hulgas on 2-jodoindooli seondumisväärtus -5,248 kcal/mol, mis tuleneb selle peamisest vesiniksidemest leutsiiniga 218. Teiste teadaolevate seondumiste hulka kuuluvad 3-jodoindool (-4,3 kcal/mol), 4-jodoindool (-4,0 kcal/mol) ja 6-fluoroindool (-6,0 kcal/mol). kcal / mol) (täiendav joonis S8). Enamik halogeenitud indoole ja indooli ennast, välja arvatud 5-jodoindool ja 2-jodoindool, moodustavad sideme seriiniga 260. Asjaolu, et vesiniksideme leutsiiniga 218 viitab tõhusale retseptori-ligandi sidumisele, nagu on täheldatud ivermektiini puhul (täiendav joonis S5-iodoindoinle- ja iodoindoinle-7) 2-jodoindool, nagu ivermektiin, seondub tihedalt GluCL retseptori aktiivse saidiga leutsiini 218 kaudu (joonis 6 ja täiendav joonis S8). Teeme ettepaneku, et see seondumine on vajalik GluCL-kompleksi avatud pooride struktuuri säilitamiseks ja et 5-jodoindool, 2-jodoindool, avermektiin ja ivermektiin, seondudes tihedalt GluCL-i retseptori aktiivse saidiga, hoiavad ioonikanali avatuna ja võimaldavad vedeliku omastamist.
Indooli ja halogeenitud indooli molekulaarne dokkimine GluCL-iga. (A) indooli, (B) 4-fluoroindooli, (C) 7-jodoindooli ja (D) 5-jodoindooli ligandide seondumisorientatsioonid GluCL-i aktiivse saidiga. Valku tähistab lint ja selgroo vesiniksidemed on näidatud kollaste punktiirjoontena. (A'), (B'), (C') ja (D') näitavad vastavate ligandide koostoimeid ümbritsevate aminohappejääkidega ning külgahela vesiniksidemed on tähistatud roosade punktiirnooltega.
Viidi läbi katsed, et hinnata 5-jodoindooli toksilist toimet kapsa ja redise seemnete idanemisele. 5-jodoindool (0,05 või 0,1 mM) või avermektiin (10 μg/ml) ei mõjutanud esialgset idanemist ja taimede tärkamist (joonis 7). Lisaks ei leitud olulist erinevust töötlemata kontrollide ja 5-jodoindooli või avermektiiniga töödeldud seemnete idanemiskiiruse vahel. Mõju tajuure pikenemisele ja moodustunud külgjuurte arvule oli ebaoluline, kuigi 1 mM (10 korda selle aktiivne kontsentratsioon) 5-jodoindooli aeglustas veidi külgjuurte arengut. Need tulemused näitavad, et 5-jodoindool ei ole taimerakkudele toksiline ega sega uuritud kontsentratsioonidel taimede arenguprotsesse.
5-jodoindooli mõju seemnete idanemisele. B. oleracea ja R. raphanistrum seemnete idanemine, tärkamine ja külgmine juurdumine Murashige ja Skoog agarisöötmel avermektiini või 5-jodoindooliga või ilma. Idanemine registreeriti pärast 3-päevast inkubeerimist 22 °C juures.
Selles uuringus kirjeldatakse mitmeid indoolide poolt põhjustatud nematoodide tapmise juhtumeid. Oluline on see, et see on esimene teade jodoindooli indutseerimisest metülatsiooni (protsess, mis on põhjustatud väikeste vakuoolide kuhjumisest, mis sulanduvad järk-järgult hiiglaslikeks vakuoolideks, mis lõpuks viib membraani rebenemiseni ja surmani) männiokkades, kusjuures jodoindoolil on märkimisväärsed nematitsiidsed omadused, mis on sarnased kaubandusliku nematiidi avermiidiga.
Varem on teatatud, et indoolid avaldavad prokarüootides ja eukarüootides mitmeid signaalimisfunktsioone, sealhulgas biokile inhibeerimist / moodustumist, bakterite ellujäämist ja patogeensust 19, 32, 33, 34. Hiljuti on halogeenitud indoolide, indoolalkaloidide ja poolsünteetiliste indooli derivaatide võimalik terapeutiline toime äratanud ulatuslikku uurimishuvi35, 36, 37. Näiteks on näidatud, et halogeenitud indoolid tapavad püsivaid Escherichia coli ja Staphylococcus aureus rakke37. Lisaks pakub teaduslikku huvi uurida halogeenitud indoolide efektiivsust teiste liikide, perekondade ja kuningriikide vastu ning see uuring on samm selle eesmärgi saavutamise suunas.
Siin pakume välja mehhanismi 5-jodoindooli poolt indutseeritud letaalsuseks C. elegansis, mis põhineb pöörduval rakukahjustusel (RCI) ja metüülimisel (joonised 4C ja 5). Turselised muutused, nagu tursed ja vakuolaarne degeneratsioon, on RCI ja metüülimise näitajad, mis avalduvad tsütoplasmas olevate hiiglaslike vakuoolidena 48, 49. RCI häirib energia tootmist, vähendades ATP tootmist, põhjustades ATPaasi pumba rikke või rikkudes rakumembraane ning põhjustades Na+, Ca2+ ja vee kiiret sissevoolu50,51,52. Intratsütoplasmaatilised vakuoolid tekivad loomarakkudes Ca2+ ja vee sissevoolu tõttu vedeliku kogunemise tagajärjel tsütoplasmas53. Huvitav on see, et see rakukahjustuse mehhanism on pöörduv, kui kahjustus on ajutine ja rakud hakkavad teatud aja jooksul ATP-d tootma, kuid kui kahjustus püsib või süveneb, siis rakud surevad.54 Meie tähelepanekud näitavad, et 5-jodoindooliga töödeldud nematoodid ei suuda pärast stressitingimustega kokkupuudet taastada normaalset biosünteesi.
5-jodoindooli poolt B. xylophiluses indutseeritud metüülimise fenotüüp võib olla tingitud joodi olemasolust ja selle molekulaarsest jaotusest, kuna 7-jodoindoolil oli B. xylophilusele vähem inhibeeriv toime kui 5-jodoindoolil (tabel 1 ja täiendav joonis S6). Need tulemused on osaliselt kooskõlas Maltese jt uuringutega. (2014), kes teatas, et püridüüli lämmastikuosa translokatsioon indoolis para-asendist meta-asendisse kaotas vakuolisatsiooni, kasvu pärssimise ja tsütotoksilisuse U251 rakkudes, mis viitab sellele, et molekuli interaktsioon valgu spetsiifilise aktiivse saidiga on kriitiline27, 44, 45. Selles uuringus täheldatud interaktsioonid indooli või halogeenitud indoolide ja GluCL retseptorite vahel toetavad samuti seda arusaama, kuna leiti, et 5- ja 2-jodoindool seonduvad GluCL retseptoritega tugevamini kui teised uuritud indoolid (joonis 6 ja täiendav joonis S8). Leiti, et indooli teises või viiendas positsioonis olev jood seondub GluCL retseptori leutsiiniga 218 vesiniksidemete kaudu, samas kui teised halogeenitud indoolid ja indool ise moodustavad seriiniga 260 nõrgad külgahela vesiniksidemed (joonis 6). Seetõttu oletame, et halogeeni lokaliseerimine mängib olulist rolli vaakumi degeneratsiooni esilekutsumisel, samas kui 5-jodoindooli tihe sidumine hoiab ioonikanali avatuna, võimaldades seeläbi vedeliku kiiret sissevoolu ja vakuooli rebenemist. 5-jodoindooli üksikasjalik toimemehhanism tuleb siiski kindlaks teha.
Enne 5-jodoindooli praktilist kasutamist tuleks analüüsida selle toksilist toimet taimedele. Meie seemnete idanemiskatsed näitasid, et 5-jodoindoolil ei olnud uuritud kontsentratsioonidel negatiivset mõju seemnete idanemisele ega sellele järgnevatele arenguprotsessidele (joonis 7). Seega annab käesolev uuring aluse 5-jodoindooli kasutamisele ökoloogilises keskkonnas, et kontrollida männi nematoodide kahjulikkust männipuudele.
Varasemad aruanded on näidanud, et indoolipõhine ravi kujutab endast potentsiaalset lähenemisviisi antibiootikumiresistentsuse ja vähi progresseerumise probleemi lahendamiseks55. Lisaks on indoolidel antibakteriaalne, vähivastane, antioksüdantne, põletikuvastane, diabeedivastane, viirusevastane, antiproliferatiivne ja tuberkuloosivastane toime ning need võivad olla paljulubavaks aluseks ravimite väljatöötamisel56,57. See uuring viitab esimest korda joodi võimalikule kasutamisele parasiidivastase ja anthelmintikumina.
Avermektiin avastati kolm aastakümmet tagasi ja pälvis 2015. aastal Nobeli preemia ning selle kasutamine anthelmintikumina on endiselt aktiivne. Kuna aga nematoodide ja putukakahjurite resistentsus avermektiinide suhtes areneb kiiresti, on männipuude männi nematoodi nakatumise tõrjeks vaja alternatiivset, odavat ja keskkonnasõbralikku strateegiat. Selles uuringus kirjeldatakse ka mehhanismi, mille abil 5-jodoindool tapab männi nematoodid ja et 5-jodoindoolil on taimerakkudele madal toksilisus, mis avab head väljavaated selle tulevaseks kaubanduslikuks kasutamiseks.
Kõik katsed kiitis heaks Koreas Gyeongsanis asuva Yeungnami ülikooli eetikakomitee ja meetodid viidi läbi vastavalt Yeungnami ülikooli eetikakomitee juhistele.
Munade inkubeerimise katsed viidi läbi kehtestatud protseduure kasutades43. Haudesageduse (HR) hindamiseks viidi 1-päevased täiskasvanud nematoodid (umbes 100 emast ja 100 isast) seeni sisaldavatele Petri tassidele ja lasti 24 tundi kasvada. Seejärel munad isoleeriti ja töödeldi 5-jodoindooliga (0,05 mM ja 0,1 mM) või avermektiiniga (10 μg/ml) suspensioonina steriilses destilleeritud vees. Need suspensioonid (500 μl; ligikaudu 100 muna) kanti 24-süvendilise koekultuuriplaadi süvenditesse ja inkubeeriti 22 °C juures. L2 loendus tehti pärast 24-tunnist inkubeerimist, kuid peeti surnuks, kui rakud peene plaatinatraadiga stimuleerimisel ei liikunud. See katse viidi läbi kahes etapis, millest igaühes oli kuus kordust. Mõlema katse andmed ühendati ja esitati. HR protsent arvutatakse järgmiselt:
Vastsete suremust hinnati varem välja töötatud protseduuride abil. Nematoodimunad koguti ja embrüod sünkroniseeriti steriilses destilleeritud vees haududes, et tekitada L2 staadiumis vastsed. Sünkroniseeritud vastseid (ligikaudu 500 nematoodi) töödeldi 5-jodoindooliga (0,05 mM ja 0,1 mM) või avermektiiniga (10 μg/ml) ja kasvatati B. cinerea Petri plaatidel. Pärast 48-tunnist inkubeerimist 22 ° C juures koguti nematoodid steriilsesse destilleeritud vette ja uuriti L2, L3 ja L4 staadiumide olemasolu. L3 ja L4 staadiumide olemasolu näitas vastsete transformatsiooni, samas kui L2 staadium ei näidanud transformatsiooni. Pildid saadi iRiS™ digitaalse rakukujutise süsteemi abil. See katse viidi läbi kahes etapis, millest igaühes oli kuus kordust. Mõlema katse andmed ühendati ja esitati.
5-jodoindooli ja avermektiini toksilisust seemnetele hinnati idanemiskatsete abil Murashige ja Skoogi agariplaatidel.62 B. oleracea ja R. raphanistrum seemneid leotati esmalt steriilses destilleeritud vees üks päev, pesti 1 ml 100% etanooliga, 50%1ble, steriliseeritud. hüpoklorit) 15 minutit ja pesti viis korda 1 ml steriilse veega. Seejärel pressiti steriliseeritud seemned idanemisagarplaatidele, mis sisaldasid 0,86 g/l (0,2X) Murashige ja Skoog söödet ja 0,7% bakterioloogilist agarit koos 5-jodoindooli või avermektiiniga või ilma. Seejärel inkubeeriti plaate temperatuuril 22 ° C ja pildid tehti pärast 3-päevast inkubeerimist. See katse viidi läbi kahes etapis, millest igaühes oli kuus kordust.
Postitusaeg: 26. veebruar 2025