Täname teid Nature.com-i külastamise eest. Teie kasutataval brauseri versioonil on piiratud CSS-i tugi. Parima tulemuse saavutamiseks soovitame teil kasutada brauseri uuemat versiooni (või keelata Internet Exploreris ühilduvusrežiimi). Seni aga kuvame saiti ilma stiili ja JavaScriptita, et tagada pidev tugi.
Looduslike toodete avastamine ja kasulik kasutamine aitab parandada inimeste elu. Taimekasvu pärssivaid kemikaale kasutatakse laialdaselt umbrohutõrjeks herbitsiididena. Kuna on vaja kasutada erinevat tüüpi herbitsiide, on vaja leida ühendeid, millel on uued toimemehhanismid. Selles uuringus avastasime Streptomyces werraensis MK493-CF1-st uudse N-alkoksüpürrooli ühendi, kumamonamiidi, ja määrasime kindlaks täieliku sünteesiprotsessi. Bioloogilise aktiivsuse testide abil avastasime, et urs-monoaamhape on urs-monoamiidi sünteetiline vaheühend ja potentsiaalne...taimekasvu inhibiitorLisaks oleme välja töötanud mitmesuguseid urbenoonhappe derivaate, sealhulgas urbenüüloksüderivaadi (UDA), millel on kõrge herbitsiidne toime ilma HeLa rakkude kasvu negatiivselt mõjutamata. Samuti leidsime, et urmotoonhappe derivaadid lõhustavad taimede mikrotubuule; lisaks mõjutab KAND aktiini filamente ja kutsub esile rakusurma; need mitmetahulised toimed erinevad teadaolevate mikrotubuuluste inhibiitorite omadest ja viitavad ursonhappe uuele toimemehhanismile, mis on oluline eelis uute herbitsiidide väljatöötamisel.
Kasulike looduslike saaduste ja nende derivaatide avastamine ja praktiline rakendamine on vahend inimelu kvaliteedi parandamiseks. Mikroorganismide, taimede ja putukate poolt toodetud sekundaarsed metaboliidid on toonud kaasa suuri edusamme meditsiinis ja põllumajanduses. Looduslikest saadustest on välja töötatud palju antibiootikume ja leukeemiavastaseid ravimeid. Lisaks on mitmesuguseidpestitsiididNendest looduslikest saadustest ekstraheeritakse põllumajanduses kasutamiseks fungitsiide ja herbitsiide. Eelkõige on umbrohutõrje herbitsiidid olulised vahendid saagikuse suurendamiseks tänapäeva põllumajanduses ning mitmesuguseid ühendeid kasutatakse juba kaubanduslikult. Herbitsiidide tüüpilisteks sihtmärkideks peetakse mitmeid taimede rakulisi protsesse, nagu fotosüntees, aminohapete metabolism, rakuseina süntees, mitoosi reguleerimine, fütohormoonide signaalimine või valgu süntees. Ühendid, mis inhibeerivad mikrotuubulite funktsiooni, on tavaline herbitsiidide klass, mis mõjutavad taimede kasvu mitootilise regulatsiooni mõjutamise kaudu.
Mikrotuubulid on tsütoskeleti komponendid ja on eukarüootsetes rakkudes laialdaselt konserveerunud. Tubuliini heterodimeer koosneb α-tubuliinist ja β-tubuliinist, moodustades lineaarseid mikrotuubulite protofilamente, kusjuures 13 protofilamenti moodustavad silindrilise struktuuri. Mikrotuubulitel on taimerakkudes mitu rolli, sealhulgas raku kuju, rakkude jagunemise ja rakusisese transpordi määramine3,4. Taimerakud sisaldavad mikrotuubuleid interfaasi plasmamembraani all ja arvatakse, et need niinimetatud kortikaalsed mikrotuubulid kontrollivad tselluloosmikrofibrillide organiseerumist tselluloossüntaasi komplekside reguleerimise kaudu4,5. Juureepidermise rakkude kortikaalsed mikrotuubulid, mis asuvad juuretipu kiire pikenemise tsoonis, paiknevad külgsuunas ja tselluloosmikrokiud järgnevad neile mikrotuubulitele ja piiravad rakkude laienemise suunda, soodustades seeläbi anisotroopset rakkude pikenemist. Seetõttu on mikrotuubulite funktsioon tihedalt seotud taime morfoloogiaga. Aminohapete asendused tubuliini kodeerivates geenides põhjustavad kortikaalsete mikrotuubulite massiivide kalduvust ja vasak- või parempoolset kasvu Arabidopsis'el 6,7. Samamoodi võivad mikrotubululistega seotud valkude mutatsioonid, mis reguleerivad mikrotubululiste dünaamikat, põhjustada ka moonutatud juurte kasvu8,9,10,11,12,13. Lisaks põhjustab mikrotubuluseid lõhustavate herbitsiididega, näiteks disopüramiidiga, tuntud ka kui pretilakloor, töötlemine ka vasakpoolset kaldus juurte kasvu14. Need andmed näitavad, et mikrotubululiste funktsiooni täpne reguleerimine on taime kasvusuuna määramisel kriitilise tähtsusega.
On avastatud mitmesuguseid mikrotuubulite inhibiitoreid ja need ravimid on andnud olulise panuse tsütoskeleti uuringutesse, samuti põllumajandusse ja meditsiini.2 Eelkõige võivad orüsaliin, dinitroaniliini ühendid, disopüramiid, bensamiidiga seotud ühendid ja nende analoogid pärssida mikrotuubulite funktsiooni ja seeläbi taimede kasvu. Seetõttu kasutatakse neid laialdaselt herbitsiididena. Kuna mikrotuubulid on taime- ja loomarakkude oluline komponent, on enamik mikrotuubulite inhibiitoreid tsütotoksilised mõlema rakutüübi suhtes. Seetõttu, hoolimata nende tunnustatud kasulikkusest herbitsiididena, kasutatakse praktilistel eesmärkidel piiratud arvu mikrotuubulite vastaseid aineid.
Streptomyces on Streptomycese sugukonda kuuluv perekond, mis hõlmab aeroobseid, grampositiivseid ja filamentseid baktereid ning on laialdaselt tuntud oma võime poolest toota laia valikut sekundaarseid metaboliite. Seetõttu peetakse seda üheks olulisemaks uute bioloogiliselt aktiivsete looduslike saaduste allikaks. Käesolevas uuringus avastasime uue ühendi nimega kumamonamiidi, mis eraldati Streptomyces werraensis MK493-CF1 ja S. werraensis ISP 5486 bakteritest. Spektraalanalüüsi ja täieliku spektraalanalüüsi abil iseloomustati kumamonamiidi struktuuri ja määrati selle ainulaadne N-alkoksüpürroolskelett. Leiti, et ursmonoamiidi ja selle derivaatide sünteetiline vaheühend, pärsib populaarse mudeltaime Arabidopsis thaliana kasvu ja idanemist. Struktuuri-aktiivsuse seose uuringus leidsime, et ursoonhappeks modifitseeritud C9-ga ühend, mida nimetatakse ursoonhappe nonüüloksüderivaadiks (KAND), suurendab oluliselt kasvu ja idanemist pärssivat toimet. Tähelepanuväärne on see, et äsja avastatud taimekasvu inhibiitor mõjutas ka tubaka ja maksarohu kasvu ning ei olnud tsütotoksiline bakteritele ega HeLa rakkudele. Lisaks kutsuvad mõned urmotoonhappe derivaadid esile moonutatud juurefenotüübi, mis viitab sellele, et need derivaadid mõjutavad otseselt või kaudselt mikrotubuluseid. Selle ideega kooskõlas näitavad meie tähelepanekud kas immunohistokeemiliselt või fluorestseeruvate valkudega märgistatud mikrotubulusite kohta, et KAND-töötlus depolümeriseerib mikrotubuluseid. Lisaks lõhustas kumamotoonhappe derivaatidega töötlemine aktiini mikrofilamente. Seega oleme avastanud uue taimekasvu inhibiitori, mille ainulaadne toimemehhanism hõlmab tsütoskeleti hävitamist.
Tüvi MK493-CF1 eraldati pinnasest Shinagawa-kus Tokyos. Tüvi MK493-CF1 moodustas hästi hargnenud strooma seeneniidistiku. Määrati kindlaks 16S ribosomaalse RNA geeni osaline järjestus (1422 bp). See tüvi on väga sarnane S. werraensis'ega (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: tüüpiline tüvi, 99,93%). Selle tulemuse põhjal tehti kindlaks, et see tüvi on lähedane sugulus S. werraensis'e tüüptüvega. Seetõttu panime sellele tüvele ajutiseks nimeks S. werraensis MK493-CF1. Ka S. werraensis ISP 5486T toodab samu bioaktiivseid ühendeid. Kuna selle mikroorganismi looduslike saaduste saamise kohta oli varases staadiumis vähe uuringuid, viidi läbi täiendavaid keemilisi uuringuid. Pärast S. werraensis MK493-CF1 kultiveerimist odra söötmel tahkefaasilise kääritamise teel temperatuuril 30 °C 14 päeva jooksul ekstraheeriti söödet 50% EtOH-ga. 60 ml proovi kuivatati, et saada 59,5 mg toorekstrakti. Toorekstrakti töödeldi pöördfaasilise HPLC-ga, et saada N-metoksü-1H-pürrool-2-karboksamiid (1, nimetatud kumamonamiidiks, 36,0 mg). Ühendi 1 koguhulk moodustab ligikaudu 60% toorekstraktist. Seetõttu otsustasime kumamotoamiidi 1 omadusi üksikasjalikult uurida.
Kumamonamiid 1 on valge amorfne pulber ja kõrgresolutsiooniga massispektromeetria (HRESIMS) kinnitab C6H8N2O2 olemasolu (joonis 1). Selle ühendi C2-asendatud pürrooli fragmenti iseloomustavad δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH 1H NMR spektris: 4,5 Hz, H-5) ja δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6) ning 13C NMR spekter näitab nelja sp2 süsinikuaatomi olemasolu. Amiidrühma olemasolu C2 positsioonis hinnati HMBC korrelatsiooni abil C-3 prootonist amiidkarbonüüli süsinikuni δC 161,1 juures. Lisaks viitavad 1H ja 13C NMR piigid δH 4,10 (3H, S) ja δC 68,3 juures N-metoksürühmade olemasolule molekulis. Kuigi metoksürühma õiget asendit ei olnud veel spektroskoopilise analüüsi, näiteks täiustatud diferentsiaalspektroskoopia ja tuuma-Overhauseri lühendi (NOEDF) abil kindlaks määratud, sai N-metoksü-1H-pürrool-2-karboksamiidist esimene kandidaatühend.
Ühendi 1 õige struktuuri määramiseks viidi läbi täissüntees (joonis 2a). Kaubanduslikult saadaoleva 2-aminopüridiini 2 töötlemine m-CPBA-ga andis kvantitatiivse saagisega vastava N-oksiidi 3. Pärast ühendi 2 2-aminoasideerimist viidi läbi Abramovitši kirjeldatud tsüklokondensatsioonireaktsioon benseenis temperatuuril 90 °C, saades soovitud 1-hüdroksü-1H-pürrool-2-karbonitriili 5 grammides. Kiirus 60% (kaks etappi). 15,16. Ühendi 4 metüülimine ja hüdrolüüs andis seejärel hea saagisega (70%, kaks etappi) 1-metoksü-1H-pürrool-2-karboksüülhappe (nimetatakse "kumotoonhappeks", 6). Lõpuks andis amiidimine happekloriidi vaheühendi 6 kaudu ammoniaagi vesilahusega Kumamoto amiidi 1 98% saagisega. Kõik sünteesitud ühendi 1 spektraalandmed olid sarnased eraldatud ühendiga 1, seega määrati ühendi 1 struktuur;
Urbenamiidi ja urbenhappe üldine süntees ja bioloogilise aktiivsuse analüüs. (a) Kumamoto amiidi täielik süntees. (b) Seitsmepäevaseid metsiktüüpi Arabidopsis Columbia (Col) seemikuid kasvatati Murashige ja Skoogi (MS) plaatidel, mis sisaldasid kumamonamiid 6 või kumamonamiid 1 näidatud kontsentratsioonides. Skaalariba = 1 cm.
Esmalt hindasime urbenamiidi ja selle vaheühendite bioloogilist aktiivsust taimede kasvu moduleeriva võime osas. Lisasime MS agarkeskkonda erinevates kontsentratsioonides ursmonamiidi 1 või ursmonhapet 6 ja kultiveerisime sellel keskkonnal Arabidopsis thaliana seemikuid. Need testid näitasid, et ühendi 6 kõrged kontsentratsioonid (500 μM) pärssisid juurte kasvu (joonis 2b). Seejärel genereerisime erinevaid derivaate, asendades ühendi 6 N1 positsiooni, ja viisime läbi nende struktuuri-aktiivsuse seose uuringud (analoogi sünteesiprotsessi on kirjeldatud lisamaterjalides (SI)). Arabidopsis'e seemikuid kasvatati keskkonnas, mis sisaldas 50 μM ursoonhappe derivaate, ja mõõdeti juurte pikkust, nagu pildil näidatud. Nagu on näidatud joonistel 3a, b ja S1, on kumaohapetel erineva pikkusega lineaarsed alkoksüahelad (9, 10, 11, 12 ja 13) või suured alkoksüahelad (15, 16 ja 17) N1 positsioonis. Derivaadid näitasid olulist juurte kasvu pärssimist. Lisaks leidsime, et 200 μM 10, 11 või 17 pealekandmine pärssis idanemist (joonis 3c ja S2).
Kumamoto amiidi ja sellega seotud ühendite struktuuri ja aktiivsuse seose uuring. (a) Analoogide struktuur ja sünteesiskeem. (b) 7-päevaste seemikute juurte pikkuse kvantifitseerimine, mida kasvatati MS-söötmel koos 50 μM kumamonamiidi derivaatidega või ilma. Tärnid näitavad olulisi erinevusi platseeboga võrreldes (t-test, p< 0,05). n>18. Andmed on esitatud keskmisena ± standardhälve. nt tähendab „pole testitud“, kuna üle 50% seemnetest ei idanenud. (c) Töödeldud seemnete idanemiskiiruse kvantifitseerimine, mida inkubeeriti 7 päeva MS-keskkonnas koos 200 μM kumamonamiidi ja sarnaste ühenditega või ilma. Tärnid näitavad olulisi erinevusi võrreldes kontrollraviga (hii-ruuttest). n = 96.
Huvitaval kombel vähendas C9-st pikemate alküül-külgahelate lisamine inhibeerivat aktiivsust, mis viitab sellele, et kumamotoiinhappega seotud ühendid vajavad oma bioloogilise aktiivsuse avaldamiseks teatud suurusega külgahelaid.
Kuna struktuuri-aktiivsuse seose analüüs näitas, et C9 oli modifitseeritud ursoonhappeks ja ursoonhappe nonüüloksüderivaat (edaspidi KAND 11) oli kõige efektiivsem taimekasvu inhibiitor, viisime läbi KAND 11 detailsema iseloomustuse. Arabidopsis'e töötlemine 50 μM KAND 11-ga takistas idanemist peaaegu täielikult, samas kui madalamad KAND 11 kontsentratsioonid (40, 30, 20 või 10 μM) pärssisid juurte kasvu annusest sõltuval viisil (joonis 4a, b). Et testida, kas KAND 11 mõjutab juurte meristeemi elujõulisust, uurisime propiidiumjodiidiga (PI) värvitud juurte meristeemid ja mõõtsime meristeemi pindala. 25 μM KAND-11 sisaldaval söötmel kasvatatud seemikute meristeemi suurus oli 151,1 ± 32,5 μm, samas kui DMSO-d sisaldaval kontrollsöötmel kasvatatud seemikute meristeemi suurus oli 264,7 ± 30,8 μm (joonis 4c, d), mis näitab, et KAND-11 taastab rakkude aktiivsuse. Sellega kooskõlas vähendas KAND 11 töötlemine rakkude jagunemismarkeri CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS signaali hulka juurmeristeemis (joonis 4e) 17. Need tulemused näitavad, et KAND 11 pärsib juurte kasvu, vähendades rakkude proliferatsiooni aktiivsust.
Urbenoonhappe derivaatide (urbenüüloksüderivaatide) inhibeeriva toime analüüs kasvule. (a) 7-päevased metsiktüüpi Col seemikud, mida kasvatati MS-plaatidel näidatud KAND 11 kontsentratsioonidega. Skaalariba = 1 cm. (b) Juurte pikkuse kvantifitseerimine. Tähed näitavad olulisi erinevusi (Tukey HSD test, p< 0,05). n>16. Andmed on esitatud keskmisena ± standardhälve. (c) Propiidiumjodiidiga värvitud metsiktüüpi Col juurte konfokaalne mikroskoopia, mida kasvatati MS-plaatidel 25 μM KAND 11-ga või ilma. Valged sulud näitavad juure meristeemi. Skaalariba = 100 µm. (d) Juure meristeemi suuruse kvantifitseerimine (n = 10 kuni 11). Statistilised erinevused määrati t-testi abil (p< 0,05). Tulbad tähistavad meristeemi keskmist suurust. (e) CDKB2 konstrukti sisaldava juuremeristeemi diferentsiaalse interferentsiaalse kontrasti (DIC) mikroskoopia; 1pro: CDKB2; 1-GUS värvitud ja värvitud 5-päevastel seemikutel, mida kasvatati MS-plaatidel 25 µM KAND testiga või ilma.
KAND 11 fütotoksilisust testiti täiendavalt teise kahekojalise taime, tubaka (Nicotiana tabacum) ja peamise maismaataime mudelorganismi, maksarohu (Marchantia polymorpha) abil. Nagu Arabidopsise puhul, andsid 25 μM KAND 11 sisaldaval söötmel kasvatatud tubaka SR-1 seemikud lühemaid juuri (joonis 5a). Lisaks idanes 48 seemnest 40 200 μM KAND 11 sisaldavatel plaatidel, samas kui kõik 48 seemet idanesid kontroll-töödeldud söötmel, mis näitab, et KAND-i kõrgemad kontsentratsioonid olid olulised (p< 0,05; chi test -ruut) pärssis tubaka idanemist. (Joonis 5b). Lisaks oli KAND 11 kontsentratsioon, mis pärssis bakterite kasvu maksarohus, sarnane efektiivse kontsentratsiooniga Arabidopsis'es (joonis 5c). Need tulemused näitavad, et KAND 11 võib pärssida mitmesuguste taimede kasvu. Seejärel uurisime karu monoamiididega seotud ühendite võimalikku tsütotoksilisust teistes organismides, nimelt inimese HeLa rakkudes ja Escherichia coli tüves DH5α, mis esindavad vastavalt kõrgemaid looma- ja bakterirakke. Rakkude proliferatsiooni testide seerias täheldasime, et kumamoonaamiid 1, kumamoonaamiidhape 6 ja KAND 11 ei mõjutanud HeLa ega E. coli rakkude kasvu kontsentratsioonidel 100 μM (joonis 5d, e).
KAND 11 kasvu pärssimine mitte-Arabidopsis organismides. (a) Kahe nädala vanuseid metsiktüüpi SR-1 tubaka seemikuid kasvatati vertikaalselt paigutatud MS plaatidel, mis sisaldasid 25 μM KAND 11. (b) Kahe nädala vanuseid metsiktüüpi SR-1 tubaka seemikuid kasvatati horisontaalselt paigutatud MS plaatidel, mis sisaldasid 200 μM KAND 11. (c) Kahe nädala vanuseid metsiktüüpi Tak-1 maksarohu pungi kasvatati Gamborg B5 plaatidel näidatud KAND 11 kontsentratsioonidega. Punased nooled näitavad eoseid, mille kasv lakkas kahe nädala jooksul inkubatsiooniperioodi jooksul. (d) HeLa rakkude proliferatsiooni test. Elujõuliste rakkude arvu mõõdeti fikseeritud ajavahemike järel, kasutades rakkude loendamise komplekti 8 (Dojindo). Kontrollina töödeldi HeLa rakke 5 μg/ml aktinomütsiin D-ga (Act D), mis inhibeerib RNA polümeraasi transkriptsiooni ja põhjustab rakkude surma. Analüüsid viidi läbi kolmes korduses. (e) E. coli rakkude proliferatsiooni test. E. coli kasvu analüüsiti OD600 mõõtmisega. Kontrollina töödeldi rakke 50 μg/ml ampitsilliiniga (Amp), mis pärsib bakteriaalse rakuseina sünteesi. Analüüsid viidi läbi kolmes korduses.
Uramiidiga seotud ühendite põhjustatud tsütotoksilisuse toimemehhanismi dešifreerimiseks analüüsisime uuesti mõõduka inhibeeriva toimega urbenhappe derivaate, nagu pildil näidatud. Nagu joonistel 2b, 6a näidatud, andsid kõrge kontsentratsiooniga (200 μM) urmotoonhapet 6 sisaldavatel agarplaatidel kasvatatud seemikud lühemaid ja vasakule kaarduvaid juuri (θ = –23,7 ± 6,1), samas kui kontrollkeskkonnas kasvatatud seemikutel andsid seemikud peaaegu sirged juured (θ = –3,8 ± 7,1). See iseloomulik kaldus kasv on teadaolevalt tingitud kortikaalsete mikrotuubulite düsfunktsioonist14,18. Selle leiuga kooskõlas kutsusid mikrotuubuleid destabiliseerivad ravimid disopüramiid ja orüsaliin meie kasvutingimustes esile sarnase juurte kaldumise (joonis 2b, 6a). Samal ajal testisime urmotoonhappe derivaate ja valisime välja mitu neist, mis teatud kontsentratsioonides kutsusid esile kaldus juurte kasvu. Ühendid 8, 9 ja 15 muutsid juurte kasvu suunda vastavalt 75 μM, 50 μM ja 40 μM juures, mis näitab, et need ühendid võivad mikrotubuluseid tõhusalt destabiliseerida (joonis 2b, 6a). Testisime ka kõige tugevamat ursoolhappe derivaati KAND 11 madalamas kontsentratsioonis (15 µM) ja leidsime, et KAND 11 manustamine pärssis juurte kasvu ning juurte kasvu suund oli ebaühtlane, kuigi need kaldusid vasakule kalduma (joonis C3). Kuna mikrotubuluseid destabiliseerivate ravimite suuremad kontsentratsioonid mõnikord pigem pärsivad taimekasvu kui põhjustavad juurte kaldumist, hindasime seejärel võimalust, et KAND 11 mõjutab mikrotubuluseid, jälgides juure epidermise rakkudes kortikaalseid mikrotubuluseid. Immunohistokeemia, kasutades β-tubuliini vastaseid antikehi 25 μM KAND 11-ga töödeldud seemikute juurte epidermise rakkudes, näitas peaaegu kõigi kortikaalsete mikrotubuluse kadumist epidermise rakkudes elongatsioonitsoonis (joonis 6b). Need tulemused näitavad, et kumamotoonhape ja selle derivaadid toimivad mikrotubuluseid otseselt või kaudselt, neid häirides, ning et need ühendid on uudsed mikrotubululite inhibiitorid.
Ursoonhape ja selle derivaadid muudavad Arabidopsis thaliana kortikaalseid mikrotuubuleid. (a) Juure kaldenurk, mõõdetuna erinevate urmotoonhappe derivaatide juuresolekul näidatud kontsentratsioonides. Analüüsiti ka kahe mikrotuubuleid inhibeeriva ühendi, disopüramiidi ja orüsaliini, mõju. Joonisel on näidatud juurte kasvunurga mõõtmiseks kasutatud standard. Tärnid näitavad olulisi erinevusi platseeboga võrreldes (t-test, p-test).< 0,05). n>19. Skaalariba = 1 cm. (b) Kortikaalsed mikrotuubulid epidermise rakkudes elongatsioonitsoonis. Metsiktüüpi Arabidopsis Col juurte mikrotuubulid, mida kasvatati MS-plaatidel 25 μM KAND 11-ga või ilma, visualiseeriti immunohistokeemilise värvimise abil, kasutades β-tubuliini primaarseid antikehi ja Alexa Fluor-konjugeeritud sekundaarseid antikehi. Skaalariba = 10 µm. (c) Mikrotuubulite mitootiline struktuur juure meristeemis. Mikrotuubulid visualiseeriti immunohistokeemilise värvimise abil. Mitootilised struktuurid, sealhulgas profaasitsoonid, spindlid ja fragmoplastid, loendati konfokaalsetelt piltidelt. Nooled näitavad mitootiliste mikrotuubulite struktuure. Tärnid näitavad olulisi erinevusi võrreldes kontrollraviga (t-test, p-test).< 0,05). n>9. Skaalariba = 50 µm.
Kuigi Ursal on võime mikrotuubulite funktsiooni häirida, eeldatakse, et selle toimemehhanism erineb tüüpilistest mikrotuubulite depolümeriseerivatest ainetest. Näiteks indutseerivad mikrotuubulite depolümeriseerivate ainete, näiteks disopüramiidi ja orüsaliini, suuremad kontsentratsioonid epidermise rakkude anisotroopset laienemist, samas kui KAND 11 seda ei tee. Lisaks põhjustas KAND 11 ja disopüramiidi koosmanustamine disopüramiidi poolt indutseeritud juurte kasvureaktsiooni ja täheldati KAND 11 poolt indutseeritud kasvu pärssimist (joonis S4). Analüüsisime ka ülitundliku disopüramiidi 1-1 (phs1-1) mutandi reaktsiooni KAND 11-le. phs1-1-l on mittekanooniline tubuliinkinaasi punktmutatsioon ja see annab disopüramiidiga töötlemisel lühemaid juuri9,20. KAND 11 sisaldaval agarsöötmel kasvatatud phs1-1 mutantsetel seemikutel olid lühemad juured, mis sarnanesid disopüramiidil kasvatatutega (joonis S5).
Lisaks täheldasime KAND 11-ga töödeldud seemikute juuremeristeemis mitootilisi mikrotuubulite struktuure, nagu profaasitsoonid, spindlid ja fragmoplastid. Kooskõlas CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS puhul tehtud tähelepanekutega täheldati mitootiliste mikrotuubulite arvu olulist vähenemist (joonis 6c).
KAND 11 tsütotoksilisuse iseloomustamiseks subtsellulaarsel resolutsioonil töödeldi tubaka BY-2 suspensioonirakke KAND 11-ga ja jälgiti nende reaktsiooni. Esmalt lisasime KAND 11 BY-2 rakkudele, mis ekspresseerivad TagRFP-TUA6-d, mis fluorestsentselt märgistab mikrotuubuleid, et hinnata KAND 11 mõju kortikaalsetele mikrotuubulitele. Kortikaalsete mikrotuubulite tihedust hinnati pildianalüüsi abil, mis kvantifitseeris tsütoskeleti pikslite protsenti tsütoplasmaatiliste pikslite hulgas. Analüüsi tulemused näitasid, et pärast töötlemist 50 μM või 100 μM KAND 11-ga 1 tunni jooksul vähenes tihedus oluliselt vastavalt 0,94 ± 0,74% või 0,23 ± 0,28%-ni, samas kui DMSO-ga töödeldud rakkude tihedus oli 1,61 ± 0,34% (joonis 7a). Need tulemused on kooskõlas Arabidopsis'e tähelepanekuga, et KAND 11 töötlemine indutseerib kortikaalsete mikrotuubulite depolümerisatsiooni (joonis 6b). Samuti uurisime BY-2 liini GFP-ABD-märgistatud aktiini filamentidega pärast töötlemist sama kontsentratsiooniga KAND 11-ga ja täheldasime, et KAND 11-ga töötlemine katkestas aktiini filamentide tiheduse. Töötlemine 50 μM või 100 μM KAND 11-ga 1 tunni jooksul vähendas oluliselt aktiini filamentide tihedust vastavalt 1,20 ± 0,62% või 0,61 ± 0,26%, samas kui DMSO-ga töödeldud rakkudes oli tihedus 1,69 ± 0,51% (joonis 2). 7b). Need tulemused on vastuolus propüsamiidi, mis ei mõjuta aktiini filamente, ja latrunkuliin B, aktiini depolümerisaatori, mis ei mõjuta mikrotuubuleid, mõjudega (täiendav joonis S6). Lisaks ei mõjutanud töötlemine kumamonamiid 1, kumamonamiidhappe 6 või KAND 11-ga HeLa rakkude mikrotuubuleid (täiendav joonis S7). Seega arvatakse, et KAND 11 toimemehhanism erineb teadaolevate tsütoskeleti lõhustajate omast. Lisaks näitas meie KAND 11-ga töödeldud BY-2 rakkude mikroskoopiline vaatlus rakkude surma algust KAND 11 töötlemise ajal ja näitas, et Evansi siniseks värvunud surnud rakkude osakaal ei suurenenud oluliselt pärast 30-minutilist KAND 11 töötlemist, samas kui pärast 90-minutilist töötlemist 50 μM või 100 μM KAND-ga suurenes surnud rakkude arv vastavalt 43,7%-ni ja 80,1%-ni (joonis 7c). Kokkuvõttes näitavad need andmed, et uudne ursoolhappe derivaat KAND 11 on taimspetsiifiline tsütoskeleti inhibiitor, millel on seni tundmatu toimemehhanism.
KAND mõjutab tubaka BY-2 rakkude kortikaalseid mikrotuubuleid, aktiini filamente ja elujõulisust. (a) BY-2 rakkude kortikaalsete mikrotuubulite visualiseerimine TagRFP-TUA6 juuresolekul. KAND 11-ga (50 μM või 100 μM) või DMSO-ga töödeldud BY-2 rakke uuriti konfokaalse mikroskoopia abil. Kortikaalse mikrotuubulite tihedus arvutati 25 sõltumatu raku mikrofotode põhjal. Tähed näitavad olulisi erinevusi (Tukey HSD test, p< 0,05). Skaalariba = 10 µm. (b) BY-2 rakkude kortikaalsed aktiini filamentid, mis on visualiseeritud GFP-ABD2 juuresolekul. KAND 11-ga (50 μM või 100 μM) või DMSO-ga töödeldud BY-2 rakke uuriti konfokaalse mikroskoopia abil. Kortikaalsete aktiini filamentide tihedus arvutati 25 sõltumatu raku mikrofotode põhjal. Tähed näitavad olulisi erinevusi (Tukey HSD test, p< 0,05). Skaalariba = 10 µm. (c) Surnud BY-2 rakkude vaatlemine Evansi sinise värvimise abil. KAND 11-ga (50 μM või 100 μM) või DMSO-ga töödeldud BY-2 rakke uuriti erevälja mikroskoopia abil. n = 3. Skaalariba = 100 µm.
Uute looduslike saaduste avastamine ja rakendamine on toonud kaasa olulisi edusamme inimelu erinevates aspektides, sealhulgas meditsiinis ja põllumajanduses. Loodusvaradest kasulike ühendite saamiseks on läbi viidud ajaloolisi uuringuid. Eelkõige on teada, et aktinomütseedid on kasulikud nematoodide parasiidivastaste antibiootikumidena tänu oma võimele toota mitmesuguseid sekundaarseid metaboliite, nagu avermektiin, ivermektiini ja bleomütsiini ning selle derivaatide põhiühend, mida kasutatakse meditsiinis vähivastase ainena21,22. Samuti on aktinomütseetidest avastatud mitmesuguseid herbitsiidseid ühendeid, millest mõnda kasutatakse juba kaubanduslikult1,23. Seetõttu peetakse aktinomütseedi metaboliitide analüüsi soovitud bioloogilise aktiivsusega looduslike saaduste eraldamiseks tõhusaks strateegiaks. Selles uuringus avastasime S. werraensis'est uue ühendi, kumamonamiidi, ja sünteesisime selle edukalt. Ursoonhape on urbenamiidi ja selle derivaatide sünteetiline vaheühend. See võib põhjustada iseloomulikku juurte kõverdumist, omada mõõdukat kuni tugevat herbitsiidset aktiivsust ning kahjustada otseselt või kaudselt taimede mikrotuubuleid. Urmotoonhappe toimemehhanism võib aga erineda olemasolevate mikrotuubulite inhibiitorite omast, kuna KAND 11 lõhub samuti aktiini filamente ja põhjustab rakkude surma, mis viitab regulatiivsele mehhanismile, mille abil urmotoonhape ja selle derivaadid mõjutavad laia tsütoskeleti struktuuride valikut.
Urbenoonhappe edasine üksikasjalik iseloomustus aitab paremini mõista urbenoonhappe toimemehhanismi. Järgmine eesmärk on eelkõige hinnata ursonhappe võimet seonduda redutseeritud mikrotuubulitega, et teha kindlaks, kas ursonhape ja selle derivaadid toimivad mikrotuubulitele otse ja depolümeriseerivad neid või kas nende toime põhjustab mikrotuubulite destabiliseerumist. Lisaks, juhul kui mikrotuubulid ei ole otsene sihtmärk, aitab ursonhappe toimekoha ja molekulaarsete sihtmärkide tuvastamine taimerakkudel paremini mõista seotud ühendite omadusi ja võimalikke viise herbitsiidse toime parandamiseks. Meie bioaktiivsuse test näitas ursonhappe ainulaadset tsütotoksilist võimet selliste taimede nagu Arabidopsis thaliana, tubaka ja maksarohi kasvule, samas kui E. coli ega HeLa rakke see ei mõjutanud. Vähene või olematu toksilisus loomarakkudele on ursonhappe derivaatide eelis, kui need on välja töötatud herbitsiididena kasutamiseks avatud põllumajandusmaadel. Kuna mikrotuubulid on eukarüootides tavalised struktuurid, on nende selektiivne pärssimine taimedes herbitsiidide peamine nõue. Näiteks propüsamiidi, mikrotuubulite depolümeriseerivat ainet, mis seondub otse tubuliiniga ja pärsib polümerisatsiooni, kasutatakse herbitsiidina selle madala toksilisuse tõttu loomarakkudele24. Erinevalt disopüramiidist on seotud bensamiididel erinev sihtmärk-spetsiifilisus. Lisaks taimemikrotuubulitele pärsib RH-4032 või bensoksamiid vastavalt ka loomarakkude või oomütseetide mikrotuubuleid ning zalilamiidi kasutatakse fungitsiidina selle madala fütotoksilisuse tõttu25,26,27. Äsja avastatud karu ja selle derivaadid näitavad taimede suhtes selektiivset tsütotoksilisust, kuid väärib märkimist, et edasised modifikatsioonid võivad muuta nende sihtmärk-spetsiifilisust, pakkudes potentsiaalselt täiendavaid derivaate patogeensete seente või oomütseetide tõrjeks.
Urbenoonhappe ja selle derivaatide ainulaadsed omadused on kasulikud herbitsiididena arendamiseks ja uurimisvahenditena kasutamiseks. Tsütoskeleti tähtsus taimerakkude kuju kontrollimisel on laialdaselt tunnustatud. Varasemad uuringud on näidanud, et taimed on välja töötanud keerukad kortikaalsete mikrotuubulite organisatsiooni mehhanismid, kontrollides mikrotuubulite dünaamikat, et morfogeneesi õigesti kontrollida. On tuvastatud suur hulk mikrotuubulite aktiivsuse reguleerimise eest vastutavaid molekule ja sellega seotud uuringud on endiselt pooleli3,4,28. Meie praegune arusaam mikrotuubulite dünaamikast taimerakkudes ei selgita täielikult kortikaalsete mikrotuubulite organisatsiooni mehhanisme. Näiteks, kuigi nii disopüramiid kui ka orüsaliin võivad mikrotuubuleid depolümeriseerida, põhjustab disopüramiid tõsist juurte moonutamist, samas kui orüsaliinil on suhteliselt kerge mõju. Lisaks põhjustavad tubuliini mutatsioonid, mis stabiliseerivad mikrotuubuleid, ka juurte dekstrorotatsiooni, samas kui paklitakseel, mis samuti stabiliseerib mikrotuubulite dünaamikat, seda ei tee. Seetõttu peaks ursoolhappe molekulaarsete sihtmärkide uurimine ja tuvastamine andma uusi teadmisi taimekortikaalsete mikrotuubulite regulatsioonist. Samamoodi annavad tulevased võrdlused moonutatud kasvu soodustavate kemikaalide, näiteks disopüramiidi ja vähem tõhusate kemikaalide, näiteks orüsaliini või kumamotoorhappe, vahel vihjeid selle kohta, kuidas moonutatud kasv toimub.
Teisest küljest on kaitsemehhanismidega seotud tsütoskeleti ümberkorraldused veel üks võimalus ursonhappe tsütotoksilisuse selgitamiseks. Patogeeni nakatumine või elitsitori viimine taimerakkudesse põhjustab mõnikord tsütoskeleti hävimist ja järgnevat rakusurma29. Näiteks on teatatud, et oomütseetidest pärinev krüptoksantiin lõhub mikrotubuleid ja aktiini filamente enne tubakarakkude surma, sarnaselt KAND-raviga toimuvale30,31. Kaitsereaktsioonide ja ursonhappe poolt indutseeritud rakuliste reaktsioonide sarnasused viisid meid hüpoteesini, et need käivitavad tavalisi rakuprotsesse, kuigi ursonhappe kiirem ja tugevam toime kui krüptoksantiinil on ilmne. Uuringud on aga näidanud, et aktiini filamentide lõhustamine soodustab spontaanset rakusurma, millega ei kaasne alati mikrotubuulide häireid29. Lisaks tuleb veel näha, kas patogeen või elitsitor põhjustab moonutatud juurte kasvu, nagu seda teevad ursonhappe derivaadid. Seega on molekulaarsed teadmised, mis seovad kaitsereaktsioone ja tsütoskeleti, atraktiivne probleem, millega tuleb tegeleda. Kasutades ära ursoonhappega seotud madalmolekulaarsete ühendite ja mitmesuguste erineva potentsiaaliga derivaatide olemasolu, võivad need pakkuda võimalusi tundmatute rakumehhanismide sihtimiseks.
Kokkuvõttes pakub mikrotubululite dünaamikat moduleerivate uute ühendite avastamine ja rakendamine võimsaid meetodeid taimerakkude kuju määramise aluseks olevate keerukate molekulaarsete mehhanismide uurimiseks. Selles kontekstis võib hiljuti väljatöötatud ühend urmotoonhape, mis mõjutab mikrotubuluseid ja aktiini filamente ning kutsub esile rakusurma, anda võimaluse dešifreerida seost mikrotubulusite kontrolli ja nende teiste mehhanismide vahel. Seega aitab keemiline ja bioloogiline analüüs urbenoonhappe abil mõista taime tsütoskeletti kontrollivaid molekulaarseid regulatiivseid mehhanisme.
S. werraensis MK493-CF1 inokuleeriti 500 ml deflektoriga Erlenmeyeri kolbi, mis sisaldas 110 ml külvikeskkonda, mis koosnes 2% (massiprotsent/mahtprotsent) galaktoosist, 2% (massiprotsent/mahtprotsent) Essence'i pastat, 1% (massiprotsent/mahtprotsent) Bacto koostisest. -soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (massiprotsent/mahtprotsent) maisiekstraktist (KOGOSTCH Co., Ltd., Jaapan), 0,2% (massiprotsent/mahtprotsent) (NH4)2SO4 ja 0,2% CaCO3 deioniseeritud vees (pH 7,4 enne steriliseerimist). Külvikultuure inkubeeriti pöörleval loksutil (180 p/min) temperatuuril 27 °C 2 päeva. Produktsioonikultiveerimine tahkefaasilise kääritamise teel. Seemnekultuur (7 ml) viidi 500 ml K-1 kolbi, mis sisaldas 40 g tootmiskeskkonda, mis koosnes 15 g pressitud odrast (MUSO Co., Ltd., Jaapan) ja 25 g deioniseeritud veest (pH-d enne steriliseerimist ei reguleeritud). Kääritamist viidi läbi temperatuuril 30 °C pimedas 14 päeva. Kääritusmaterjali ekstraheeriti 40 ml/pudel EtOH-ga ja tsentrifuugiti (1500 g, 4 °C, 10 min). Kultuuri supernatant (60 ml) ekstraheeriti 10% MeOH/EtOAc seguga. Orgaaniline kiht aurustati alandatud rõhul, saades jäägi (59,5 mg), mida töödeldi HPLC-ga gradientelueerimisega (0–10 minutit: 90%) pöördfaasikolonnis (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × pikkus 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minutit: 90% H2O/CH3CN kuni 70% H2O/CH3CN (gradient), 35–45 minutit: 90% H2O/EtOH, 45–155 minutit: 90% H2O/EtOH kuni 100% EtOH (gradient (gradient), 155–200 min: 100% EtOH) voolukiirusel 1,5 ml/min, eraldati kumamonamiid (1, 36,0 mg) valge amorfse pulbrina.
Kumamotoamiid(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H). ), 4,08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ arvutatud väärtus: 141,0659, mõõdetud väärtus: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Columbia seemned (Col-0) saadi Arabidopsis Biological Resource Centerist (ABRC) teaduslikuks kasutamiseks loal. Col-0 seemneid paljundati ja hoiti meie laboritingimustes ning kasutati metsiktüüpi Arabidopsis taimedena. Arabidopsis seemned steriliseeriti pinna pealt ja kultiveeriti poole tugevusega Murashige ja Skoogi söötmes, mis sisaldas 2% sahharoosi (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (massi/mahu) 2-(4-morfolino)etaansulfoonhapet (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) ja 1,5% agarit (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, temperatuuril 23 °C ja pideva valguse käes. phs1-1 mutandi seemned saadi T. Hashimotolt (Nara Teadus- ja Tehnoloogiainstituut).
Tüve SR-1 seemned saadi T. Hashimotolt (Nara Teadus- ja Tehnoloogiainstituut) ning neid kasutati metsiktüüpi tubakataimedena. Tubakaseemned steriliseeriti pinnapealselt ja leotati idanemise soodustamiseks kolm ööd steriilses vees, seejärel asetati need poolenisti lahusesse, mis sisaldas 2% sahharoosi, 0,05% (massi/mahu) MES-i ja 0,8% gellankummi (Fujifilm Wako Pure Chemical) (Murashige ja Skoog sööde), mille pH oli 5,7, ja inkubeeriti temperatuuril 23 °C pideva valguse käes.
Tüve Tak-1 andis T. Kohchi (Kyoto Ülikool) ja seda kasutati maksarohu uuringus standardse eksperimentaalse ühikuna. Gema saadi steriliseeritud kultiveeritud taimedest ja seejärel külvati Gamborg B5 söötmele (Fujifilm Wako Pure Chemical), mis sisaldas 1% sahharoosi ja 0,3% gellankummi, ning inkubeeriti temperatuuril 23 °C pideva valguse käes.
Tubaka BY-2 rakud (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) saadi S. Hasezawalt (Tokyo Ülikool). BY-2 rakud lahjendati 95-kordselt modifitseeritud Linsmeieri ja Skoogi söötmes ning neile lisati igal nädalal 2,4-diklorofenoksüäädikhapet 32. Rakususpensiooni segati pöörleval loksutil kiirusel 130 p/min temperatuuril 27 °C pimedas. Rakke pesti 10-kordse värske söötme mahuga ja suspendeeriti uuesti samas söötmes. BY-2 transgeensed rakuliinid, mis ekspresseerivad stabiilselt mikrotuubulite markerit TagRFP-TUA6 või aktiini filamendi markerit GFP-ABD2 lillkapsa mosaiikviiruse 35S promootori all, genereeriti kirjeldatud viisil 33, 34, 35. Neid rakuliine saab säilitada ja sünkroniseerida, kasutades protseduure, mis on sarnased algse BY-2 rakuliini puhul kasutatud protseduuridega.
HeLa rakke kultiveeriti Dulbecco modifitseeritud Eagle'i söötmes (DMEM) (Life Technologies), millele oli lisatud 10% veise loote seerumit, 1,2 U/ml penitsilliini ja 1,2 μg/ml streptomütsiini, 37 °C inkubaatoris 5% CO2-ga.
Kõik selles käsikirjas kirjeldatud katsed viidi läbi vastavalt Jaapani bioohutuse eeskirjadele ja suunistele.
Ühendid lahustati dimetüülsulfoksiidis (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) põhilahustena ja lahjendati MS-söötmes Arabidopsis'e ja tubaka puhul või Gamborg B5 söötmes maksarohi puhul. Juurte kasvu pärssimise testis külvati üle 10 seemne plaadi kohta agar-söötmele, mis sisaldas näidatud ühendeid või DMSO-d. Seemneid inkubeeriti kasvukambris 7 päeva. Seemikuid pildistati ja mõõdeti juurte pikkust. Arabidopsis'e idanemistesti jaoks külvati 48 seemet plaadi kohta agar-söötmele, mis sisaldas 200 μM ühendit või DMSO-d. Arabidopsis'e seemneid kasvatati kasvukambris ja idandatud seemikute arv loendati 7 päeva pärast idanemist (dag). Tubaka idanemistesti jaoks külvati 24 seemet plaadi kohta agar-söötmele, mis sisaldas 200 μM KAND-i või DMSO-d. Tubakaseemneid kasvatati kasvukambris ja idandatud seemikute arv loendati 14 päeva pärast. Maksarohu kasvu pärssimise testi jaoks külvati igalt plaadilt 9 embrüot agarsöötmele, mis sisaldas näidatud kontsentratsioonides KAND-i või DMSO-d, ja inkubeeriti kasvukambris 14 päeva.
Juurte meristeemorganisatsiooni visualiseerimiseks kasutage 5 mg/ml propiidiumjodiidiga (PI) värvitud seemikuid. PI signaale jälgiti fluorestsentsmikroskoopia abil, kasutades TCS SPE konfokaalset laserskaneerivat mikroskoopi (Leica Microsystems).
Juurte histokeemiline värvimine β-glükuronidaasiga (GUS) viidi läbi vastavalt Malami ja Benfey36 kirjeldatud protokollile. Seemikud fikseeriti üleöö 90% atsetoonis, värviti 1 tunni jooksul 0,5 mg/ml 5-bromo-4-kloro-3-indolüül-β-d-glükuroonhappega GUS-puhvris ja asetati hüdreeritud kloraldehüüdi lahusesse (8 g kloraalhüdraati, 2 ml vett ja 1 ml glütserooli) ning vaadeldi diferentsiaalinterferents-kontrastmikroskoopia abil, kasutades Axio Imager M1 mikroskoopi (Carl Zeiss).
Juurenurki mõõdeti 7-päevastel seemikutel, mida kasvatati vertikaalselt asetatud taldrikutel. Mõõtke juurenurka gravitatsioonivektori suunast, nagu on kirjeldatud 6. etapis.
Kortikaalsete mikrotuubulite paigutust jälgiti kirjeldatud viisil, protokolli väikeste muudatustega 37. Primaarsete ja sekundaarsete antikehadena kasutati β-tubuliini vastast antikeha (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) ja Alexa Fluor 488-konjugeeritud hiirevastast IgG-d (Thermo Fisher Scientific: A32723) vastavalt lahjendustes 1:1000 ja 1:100. Fluorestsentskujutised saadi TCS SPE konfokaalse laserskaneeriva mikroskoobi (Leica Microsystems) abil. Z-virna kujutiste saamiseks ja maksimaalse intensiivsusega projektsioonide loomiseks järgige tootja juhiseid.
HeLa rakkude proliferatsiooni test viidi läbi, kasutades Cell Counting Kit 8 (Dojindo) vastavalt tootja juhistele.
E. coli DH5α kasvu analüüsiti rakkude tiheduse mõõtmisega kultuuris spektrofotomeetriga lainepikkusel 600 nm (OD600).
Transgeensetes BY-2 rakkudes tsütoskeleti organisatsiooni jälgiti fluorestsentsmikroskoobi abil, mis oli varustatud CSU-X1 konfokaalse skaneerimisseadmega (Yokogawa) ja sCMOS-kaameraga (Zyla, Andor Technology). Tsütoskeleti tihedust hinnati pildianalüüsi abil, mis kvantifitseeris tsütoskeleti pikslite osakaalu tsütoplasmaatiliste pikslite hulgas konfokaalsetel piltidel, kasutades ImageJ tarkvara, nagu on kirjeldatud38,39.
BY-2 rakkude surma tuvastamiseks inkubeeriti rakususpensiooni alikvooti 0,05% Evansi sinisega 10 minutit toatemperatuuril. Surnud rakkude selektiivne Evansi sinisega värvimine sõltub värvaine eritumisest elujõulistest rakkudest terve plasmamembraani abil. Värvunud rakke vaadeldi erevälja mikroskoobi (BX53, Olympus) abil.
HeLa rakke kasvatati 10% FBS-iga rikastatud DMEM söötmes niisutatud inkubaatoris temperatuuril 37 °C ja 5% CO2 atmosfääris. Rakke töödeldi 6 tundi temperatuuril 37 °C 100 μM KAND 11, kumamonaamhappe 6, kumamonamiidi 1, 100 ng/ml koltsemiidiga (Gibco) või 100 ng/ml Nocodmaze'iga (Sigma). Rakke fikseeriti 10 minutit metanooliga ja seejärel 5 minutit atsetaadiga toatemperatuuril. Fikseeritud rakke inkubeeriti 2 tundi 0,5% BSA/PBS-is lahjendatud β-tubuliini primaarse antikehaga (1D4A4, Proteintech: 66240-1), pesti 3 korda TBST-ga ja seejärel inkubeeriti Alexa Fluor kitse antikehaga. 488 1 tund. – Hiire IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) ja 15 ng/ml 4',6-diamidino-2-fenüülindooli (DAPI), lahjendatud 0,5% BSA/PBS-is. Pärast kolmekordset pesemist TBST-ga vaadeldi värvunud rakke Nikon Eclipse Ti-E inverteeritud mikroskoobil. Pildid jäädvustati jahutatud Hamamatsu ORCA-R2 CCD-kaameraga, kasutades MetaMorph tarkvara (Molecular Devices).
Postituse aeg: 17. juuni 2024