Täname, et külastasite veebilehte Nature.com.Teie kasutataval brauseri versioonil on piiratud CSS-i tugi.Parimate tulemuste saavutamiseks soovitame kasutada brauseri uuemat versiooni (või keelata Internet Exploreris ühilduvusrežiim).Seni näitame pideva toe tagamiseks saiti ilma stiilita või JavaScriptita.
Looduslike toodete avastamine ja kasulik kasutamine võib aidata parandada inimeste elu.Taimekasvu inhibeerivaid kemikaale kasutatakse laialdaselt herbitsiididena umbrohtude tõrjeks.Erinevat tüüpi herbitsiidide kasutamise vajaduse tõttu on tekkinud vajadus tuvastada uue toimemehhanismiga ühendeid.Selles uuringus avastasime Streptomyces werraensis MK493-CF1-st uudse N-alkoksüpürrooli ühendi, kumamonamiidi, ja lõime täieliku sünteesiprotsessi.Bioloogilise aktiivsuse analüüside abil avastasime, et urs-monoamhape on urs-monoamiidi sünteetiline vaheühend ja potentsiaalnetaimede kasvu inhibiitor.Lisaks oleme välja töötanud erinevaid urbenoonhappe derivaate, sealhulgas urbenüüloksüderivaadi (UDA), millel on kõrge herbitsiidne toime, ilma et see mõjutaks negatiivselt HeLa rakkude kasvu.Samuti leidsime, et urmotoonhappe derivaadid rikuvad taimede mikrotuubuleid;lisaks mõjutab KAND aktiini filamente ja kutsub esile rakusurma;Need mitmetahulised toimed erinevad teadaolevate mikrotuubulite inhibiitorite omadest ja viitavad ursonhappe uuele toimemehhanismile, mis kujutab endast olulist eelist uute herbitsiidide väljatöötamisel.
Kasulike loodustoodete ja nende derivaatide avastamine ja praktiline rakendamine on vahend inimeste elukvaliteedi parandamiseks.Mikroorganismide, taimede ja putukate toodetud sekundaarsed metaboliidid on toonud kaasa suuri edusamme meditsiinis ja põllumajanduses.Paljud antibiootikumid ja leukeemiavastased ravimid on välja töötatud looduslikest toodetest.Lisaks erinevat tüüpipestitsiidid, neist looduslikest saadustest ekstraheeritakse põllumajanduses kasutamiseks mõeldud fungitsiide ja herbitsiide.Eelkõige on umbrohutõrje herbitsiidid kaasaegses põllumajanduses olulised vahendid põllukultuuride saagikuse suurendamiseks ning erinevat tüüpi ühendeid kasutatakse juba kaubanduses.Herbitsiidide tüüpilisteks sihtmärkideks peetakse mitmeid taimede rakulisi protsesse, nagu fotosüntees, aminohapete metabolism, rakuseina süntees, mitoosi reguleerimine, fütohormoonide signaalimine või valgusüntees.Mikrotuubulite funktsiooni pärssivad ühendid on tavaline herbitsiidide klass, mis mõjutavad taimede kasvu, mõjutades mitootilist regulatsiooni2.
Mikrotuubulid on tsütoskeleti komponendid ja on eukarüootsetes rakkudes laialdaselt konserveerunud.Tubuliini heterodimeer koosneb α-tubuliinist ja β-tubuliinist, mis moodustavad lineaarseid mikrotuubulite protofilamente, kusjuures 13 protofilamenti moodustavad silindrilise struktuuri.Mikrotuubulitel on taimerakkudes mitu rolli, sealhulgas raku kuju, rakkude jagunemise ja rakusisese transpordi määramine3,4.Taimerakud sisaldavad faasidevahelise plasmamembraani all mikrotuubuleid ja arvatakse, et need niinimetatud kortikaalsed mikrotuubulid kontrollivad tselluloosi mikrofibrillide organiseerimist tselluloosi süntaasi komplekside reguleerimise kaudu4,5.Juureepidermise rakkude kortikaalsed mikrotuubulid, mis asuvad juuretipu kiire pikenemise tsoonis, paiknevad külgsuunas ning tselluloosi mikrokiud järgivad neid mikrotuubuleid ja piiravad rakkude laienemise suunda, soodustades seeläbi rakkude anisotroopset pikenemist.Seetõttu on mikrotuubulite funktsioon tihedalt seotud taime morfoloogiaga.Aminohapete asendused tubuliini kodeerivates geenides põhjustavad Arabidopsis 6, 7 kortikaalsete mikrotuubulite massiivide viltu ja vasak- või parempoolset kasvu.Samamoodi võivad mutatsioonid mikrotuubulitega seotud valkudes, mis reguleerivad mikrotuubulite dünaamikat, põhjustada moonutatud juurekasvu8, 9, 10, 11, 12, 13.Lisaks põhjustab töötlemine mikrotuubuleid rikkuvate herbitsiididega, nagu disopüramiid, tuntud ka kui pretilakloor, ka vasakpoolset kaldus juurekasvu14.Need andmed näitavad, et mikrotuubulite funktsiooni täpne reguleerimine on taimede kasvu suuna määramisel kriitilise tähtsusega.
On avastatud erinevat tüüpi mikrotuubulite inhibiitoreid ja need ravimid on andnud olulise panuse tsütoskeleti uuringutesse, samuti põllumajandusse ja meditsiini2.Eelkõige võivad orüzaliin, dinitroaniliinühendid, disopüramiid, bensamiidiga seotud ühendid ja nende analoogid inhibeerida mikrotuubulite funktsiooni ja seeläbi pärssida taimede kasvu.Seetõttu kasutatakse neid laialdaselt herbitsiididena.Kuna aga mikrotuubulid on taime- ja loomarakkude oluline komponent, on enamik mikrotuubulite inhibiitoreid mõlema rakutüübi suhtes tsütotoksilised.Seetõttu, hoolimata nende tunnustatud kasulikkusest herbitsiididena, kasutatakse praktilistel eesmärkidel piiratud arvu mikrotuubulivastaseid aineid.
Streptomyces on perekond Streptomyces, mis hõlmab aeroobseid, grampositiivseid filamentseid baktereid ja on laialt tuntud oma võime poolest toota mitmesuguseid sekundaarseid metaboliite.Seetõttu peetakse seda uute bioloogiliselt aktiivsete loodustoodete üheks olulisemaks allikaks.Käesolevas uuringus avastasime uue ühendi nimega kumamonamiidi, mis eraldati Streptomyces werraensis MK493-CF1 ja S. werraensis ISP 5486. Kasutades spektraalanalüüsi ja täielikku spektraalanalüüsi, iseloomustati kumamonamiidi struktuuri ja selle ainulaadset N-alkoksüpürrooli karkassi. oli kindlaks määratud.süntees.Leiti, et ursmoonhape, ursmonoamiidi ja selle derivaatide sünteetiline vaheühend, pärsib populaarse mudeltaime Arabidopsis thaliana kasvu ja idanemist.Struktuuri ja aktiivsuse seose uuringus leidsime, et ursonhappeks modifitseeritud C9-ga ühend, mida nimetatakse ursoonhappe nonüüloksüderivaadiks (KAND), suurendab oluliselt kasvu ja idanemise pärssivat toimet.Nimelt mõjutas äsja avastatud taimekasvu inhibiitor ka tubaka ja maksarohu kasvu ega olnud tsütotoksiline bakteritele ega HeLa rakkudele.Lisaks kutsuvad mõned urmotoonhappe derivaadid esile moonutatud juure fenotüübi, mis tähendab, et need derivaadid mõjutavad otseselt või kaudselt mikrotuubuleid.Kooskõlas selle ideega näitavad meie tähelepanekud kas immunohistokeemiliselt või fluorestseeruvate valkudega märgistatud mikrotuubulite kohta, et KAND-ravi depolümeriseerib mikrotuubuleid.Lisaks häiris kumamotoonhappe derivaatidega töötlemine aktiini mikrofilamente.Seega oleme avastanud uue taimekasvu inhibiitori, mille ainulaadne toimemehhanism hõlmab tsütoskeleti hävitamist.
Tüvi MK493-CF1 eraldati Tokyos Shinagawa-ku pinnasest.Tüvi MK493-CF1 moodustas hästi hargnenud stromaalse mütseeli.Määrati 16S ribosomaalse RNA geeni osaline järjestus (1422 bp).See tüvi on väga sarnane S. werraensisega (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: tüüpiline tüvi, 99,93%).Selle tulemuse põhjal tehti kindlaks, et see tüvi oli tihedalt seotud S. werraensise tüüpi tüvega.Seetõttu andsime sellele tüvele esialgu nimeks S. werraensis MK493-CF1.S. werraensis ISP 5486T toodab samuti samu bioaktiivseid ühendeid.Kuna varakult oli vähe uuritud looduslike saaduste saamist sellest mikroorganismist, viidi läbi edasised keemilised uuringud.Pärast S. werraensis MK493-CF1 kultiveerimist odra söötmel 14-päevase tahkefaasilise fermentatsiooniga 30 °C juures ekstraheeriti söödet 50% EtOH-ga.60 ml proovi kuivatati, saades 59,5 mg toorekstrakti.Toorekstrakt allutati pöördfaasi HPLC-le, et saada N-metoksü-1 H-pürrool-2-karboksamiid (1, nimega kumamonamiid, 36,0 mg).1 üldkogus moodustab ligikaudu 60% toorekstraktist.Seetõttu otsustasime üksikasjalikult uurida kumamotoamiidi 1 omadusi.
Kumamonamiid 1 on valge amorfne pulber ja kõrglahutusega massispektromeetria (HRESIMS) kinnitab C6H8N2O2 (joonis 1).Selle ühendi C2-asendatud pürrooli fragmenti iseloomustavad 8H 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), 8H 6,78 (1H, d, J = 2,5, 8H 1H NMR spektris: 4,5 Hz , H-5) ja 8H 6,78 (1 H, d, J = 2,5 Hz, H-6) ning13C NMR spekter näitab nelja sp2 süsinikuaatomi olemasolu.Amiidrühma olemasolu positsioonis C2 hinnati HMBC korrelatsiooniga C-3 prootoni ja amiidkarbonüüli süsiniku vahel δC 161,1 juures.Lisaks näitavad1H ja13C NMR piigid 8H 4,10 (3H, S) ja δC 68,3 juures N-metoksürühmade olemasolu molekulis.Kuigi metoksürühma õiget asukohta ei olnud spektroskoopilise analüüsi, näiteks täiustatud erinevusspektroskoopia ja tuuma Overhauseri lühendi (NOEDF) abil veel kindlaks määratud, sai esimeseks kandidaatühendiks N-metoksü-1 H-pürrool-2-karboksamiid.
1 õige struktuuri määramiseks viidi läbi täielik süntees (joonis 2a).Kaubanduslikult saadava 2-aminopüridiini 2 töötlemine m-CPBA-ga andis vastava N-oksiidi 3 kvantitatiivse saagisega.Pärast ühendi 2 2-aminoasiidimist viidi Abramovitši kirjeldatud tsüklokondensatsioonireaktsioon läbi benseenis temperatuuril 90 °C, et saada soovitud 1-hüdroksü-1 H-pürrool-2-karbonitriil 5 grammides.Kiirus 60% (kaks etappi).15,16.Ühendi 4 metüülimine ja hüdrolüüs andis seejärel 1-metoksü-1 H-pürrool-2-karboksüülhappe (mida nimetatakse "kumitoonhappeks", 6) hea saagisega (70%, kaks etappi).Lõpuks andis amideerimine happekloriidi vaheühendi 6 abil ammoniaagi vesilahusega Kumamoto amiidi 1 saagisega 98%.Kõik sünteesitud 1 spektraalsed andmed olid sarnased isoleeritud 1-ga, seega määrati 1 struktuur;
Urbenamiidi ja urbeenhappe bioloogilise aktiivsuse üldine süntees ja analüüs.a ) Kumamoto amiidi täielik süntees.( b ) Seitsmepäevaseid metsiktüüpi Arabidopsis Columbia (Col) seemikuid kasvatati Murashige ja Skoog (MS) plaatidel, mis sisaldasid kumamonamiidi 6 või kumamonamiidi 1 näidatud kontsentratsioonides.Skaala riba = 1 cm.
Esiteks hindasime urbenamiidi ja selle vaheühendite bioloogilist aktiivsust nende võime suhtes taimede kasvu moduleerida.Lisasime MS-agarisöötmele erinevates kontsentratsioonides ursmonamiid 1 või ursmoonhape 6 ja sellel söötmel kultiveerisime Arabidopsis thaliana seemikuid.Need testid näitasid, et 6 kõrge kontsentratsioon (500 µM) pärssis juurte kasvu (joonis 2b).Järgmisena genereerisime erinevaid tuletisi, asendades N1 positsiooni 6 ja viisime läbi nende struktuuri ja aktiivsuse seose uuringud (analoogi sünteesi protsessi kirjeldatakse tugiteabes (SI)).Arabidopsise seemikuid kasvatati söötmel, mis sisaldas 50 μM ursonhappe derivaate, ja mõõdeti juure pikkus.nagu pildil näidatud.Nagu on näidatud joonistel 3a, b ja S1, on kumamohapetel erineva pikkusega lineaarsed alkoksüahelad (9, 10, 11, 12 ja 13) või suured alkoksüahelad (15, 16 ja 17) positsioonis N1.Derivaadid näitasid juurekasvu olulist pärssimist.Lisaks avastasime, et 200 µM 10, 11 või 17 kasutamine pärssis idanemist (joonised 3c ja S2).
Kumamoto amiidi ja sellega seotud ühendite struktuuri ja aktiivsuse seose uurimine.(a) Analoogide struktuur ja sünteesiskeem.(b) MS-söötmel kasvatatud 7-päevaste seemikute juure pikkuse kvantifitseerimine koos 50 μM kumamonamiidi derivaatidega või ilma.Tärnid näitavad olulisi erinevusi võltsraviga (t-test, lk< 0,05).n>18. Andmed on näidatud kui keskmine ± SD.nt tähendab "ei ole testitud", sest enam kui 50% seemnetest ei idanenud.(c) 7 päeva MS söötmes inkubeeritud töödeldud seemnete idanemiskiiruse kvantifitseerimine koos 200 µM kumamonamiidi ja sellega seotud ühenditega või ilma.Tärnid näitavad olulisi erinevusi võltsraviga (hii-ruut test).n = 96.
Huvitav on see, et C9-st pikemate alküüli kõrvalahelate lisamine vähendas inhibeerivat aktiivsust, mis viitab sellele, et kumamotoehappega seotud ühendid vajavad oma bioloogilise aktiivsuse näitamiseks teatud suurusega külgahelaid.
Kuna struktuuri ja aktiivsuse seose analüüs näitas, et C9 muudeti ursonhappeks ja ursonhappe nonüüloksüderivaat (edaspidi KAND 11) oli kõige tõhusam taimekasvu inhibiitor, kirjeldasime KAND 11 üksikasjalikumalt. Arabidopsise ravi 50 µM KAND 11-ga takistas peaaegu täielikult idanemist, samas kui KAND 11 madalamad kontsentratsioonid (40, 30, 20 või 10 µM) pärssisid juurekasvu annusest sõltuval viisil (joonis 4a, b).Et testida, kas KAND 11 mõjutab juure meristeemi elujõulisust, uurisime propiidiumjodiidiga (PI) värvitud juuremeristeeme ja mõõdeti meristeemi pindala suurust.25 μM KAND-11 sisaldaval söötmel kasvatatud seemikute meristeemi suurus oli 151,1 ± 32,5 μm, samas kui DMSO-d sisaldaval kontrollsöötmel kasvatatud seemikute meristeemi suurus oli 264,7 ± 30,8 μm (joonis 4c). , mis näitab, et KAND-11 taastab raku aktiivsuse.levib.Juure meristeem.Kooskõlas sellega vähendas ravi KAND 11 raku jagunemise markeri CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS signaali hulka juurmeristeemis (joonis 4e)17.Need tulemused näitavad, et KAND 11 pärsib juurte kasvu, vähendades rakkude proliferatsiooni aktiivsust.
Urbenoonhappe derivaatide (urbenüüloksüderivaatide) kasvu pärssiva toime analüüs.(a) 7-päevased metsiktüüpi Col seemikud, mida kasvatati MS plaatidel näidatud KAND 11 kontsentratsioonidega. Skaalariba = 1 cm.b) juure pikkuse kvantifitseerimine.Tähed näitavad olulisi erinevusi (Tukey HSD test, lk< 0,05).n>16. Andmed on näidatud kui keskmine ± SD.(c) MS-plaatidel kasvatatud propiidiumjodiidiga värvitud metsiktüüpi Col juurte konfokaalne mikroskoopia koos 25 μM KAND 11-ga või ilma. Valged sulud näitavad juure meristeemi.Skaalariba = 100 µm.d) juure meristeemi suuruse kvantifitseerimine (n = 10–11).Statistilised erinevused määrati t-testi abil (lk< 0,05).Tulbad tähistavad meristeemi keskmist suurust.(e) CDKB2 konstrukti sisaldava juurmeristeemi diferentsiaalse interferentsi kontrasti (DIC) mikroskoopia;1pro: CDKB2;1-GUS värviti ja värviti 5-päevastel seemikutel, mida kasvatati MS-plaatidel koos 25 uM KAND-testiga või ilma.
KAND 11 fütotoksilisust testiti täiendavalt teise kaheidulehelise taime, tubaka (Nicotiana tabacum) ja peamise maismaataimede mudelorganismi, maksarohu (Marchantia polymorpha) abil.Nagu Arabidopsise puhul, andsid 25 μM KAND 11 sisaldaval söötmel kasvatatud tubaka SR-1 seemikud lühemad juured (joonis 5a).Lisaks idanes 48 seemnest 40 200 μM KAND 11 sisaldavatel plaatidel, samas kui kõik 48 seemet idanesid imiteeritud söötmel, mis näitab, et KANDi kõrgemad kontsentratsioonid olid olulised (p< 0,05;chi test -ruut) pärssisid tubaka idanemist.(joonis 5b).Lisaks oli KAND 11 kontsentratsioon, mis pärssis bakterite kasvu maksarohus, sarnane efektiivse kontsentratsiooniga Arabidopsises (joonis 5c).Need tulemused näitavad, et KAND 11 võib pärssida erinevate taimede kasvu.Seejärel uurisime karu monoamiidiga seotud ühendite võimalikku tsütotoksilisust teistes organismides, nimelt inimese HeLa rakkudes ja Escherichia coli tüves DH5α, mis on vastavalt kõrgemate looma- ja bakterirakkude esindajad.Rakkude proliferatsioonitestide seerias täheldasime, et kumamonaamiid 1, kumamonaamiidhape 6 ja KAND 11 ei mõjutanud HeLa või E. coli rakkude kasvu kontsentratsioonidel 100 µM (joonis 5d, e).
KAND 11 kasvu pärssimine mitte-Arabidopsise organismides.(a) Kahe nädala vanuseid metsikut tüüpi SR-1 tubaka seemikuid kasvatati vertikaalselt paigutatud MS-plaatidel, mis sisaldasid 25 μM KAND 11. (b) Kahe nädala vanuseid metsikut tüüpi SR-1 tubaka seemikuid kasvatati horisontaalselt MS-plaadid, mis sisaldavad 200 μM KAND 11. (c) Kahenädalased metsiktüüpi Tak-1 maksarohu pungad, mida kasvatati Gamborg B5 plaatidel näidatud KAND 11 kontsentratsioonidega. Punased nooled näitavad eoseid, mis lakkasid kasvama kahenädalase inkubeerimise jooksul. periood.(d) HeLa rakkude rakkude proliferatsiooni test.Elujõuliste rakkude arvu mõõdeti fikseeritud ajavahemike järel, kasutades rakkude loenduskomplekti 8 (Dojindo).Kontrollina töödeldi HeLa rakke 5 μg/ml aktinomütsiin D-ga (Act D), mis inhibeerib RNA polümeraasi transkriptsiooni ja põhjustab rakusurma.Analüüsid viidi läbi kolmes eksemplaris.(e) E. coli rakkude proliferatsiooni test.E. coli kasvu analüüsiti OD600 mõõtmisega.Kontrollina töödeldi rakke 50 μg/ml ampitsilliiniga (Amp), mis pärsib bakteriraku seina sünteesi.Analüüsid viidi läbi kolmes eksemplaris.
Uramiidiga seotud ühendite põhjustatud tsütotoksilisuse toimemehhanismi dešifreerimiseks analüüsisime uuesti mõõduka inhibeeriva toimega urbeenhappe derivaate.nagu pildil näidatud.Nagu on näidatud joonistel 2b, 6a, andsid kõrges kontsentratsioonis (200 μM) urmotoonhapet 6 sisaldavatel agarplaatidel kasvatatud seemikud lühemad ja vasakpoolsed kõverad juured (θ = – 23,7 ± 6,1), samas kui kontrollsöötmel kasvatatud seemikud, seemikud andsid peaaegu sirged juured (θ = – 3,8 ± 7,1).See iseloomulik kaldus kasv tuleneb teadaolevalt kortikaalsete mikrotuubulite talitlushäiretest 14, 18.Kooskõlas selle leiuga põhjustasid mikrotuubuleid destabiliseerivad ravimid disopüramiid ja orüzaliin meie kasvutingimustes sarnase juure kallutamise (joonised 2b, 6a).Samal ajal testisime urmotoonhappe derivaate ja valisime neist välja mitu, mis teatud kontsentratsioonidel kutsusid esile kaldjuurekasvu.Ühendid 8, 9 ja 15 muutsid juurekasvu suunda vastavalt 75 µM, 50 µM ja 40 µM juures, mis näitab, et need ühendid võivad mikrotuubuleid tõhusalt destabiliseerida (joonis 2b, 6a).Testisime ka kõige tugevamat ursoolhappe derivaati KAND 11 madalamal kontsentratsioonil (15 µM) ja leidsime, et KAND 11 kasutamine pärssis juurte kasvu ja et juurte kasvu suund oli ebaühtlane, kuigi need kaldusid vasakule ( Joonis C3)..Kuna mikrotuubuleid destabiliseerivate ravimite kõrgemad kontsentratsioonid pärsivad mõnikord taimede kasvu, mitte ei põhjusta juurte kallutamist, hindasime hiljem võimalust, et KAND 11 mõjutab mikrotuubuleid, jälgides kortikaalseid mikrotuubuleid juure epidermise rakkudes.Immunohistokeemia, milles kasutati β-tubuliinivastaseid antikehi 25 μM KAND 11-ga töödeldud seemikute juurte epidermise rakkudes, näitas peaaegu kõigi kortikaalsete mikrotuubulite kadumist pikenemistsoonis olevates epidermaalsetes rakkudes (joonis 6b).Need tulemused näitavad, et kumamotoonhape ja selle derivaadid toimivad otseselt või kaudselt mikrotuubulitele, et neid häirida, ja et need ühendid on uudsed mikrotuubulite inhibiitorid.
Ursoonhape ja selle derivaadid muudavad Arabidopsis thaliana kortikaalseid mikrotuubuleid.a ) juure kaldenurk, mõõdetuna erinevate urmotoonhappe derivaatide juuresolekul näidatud kontsentratsioonidel.Samuti analüüsiti kahe teadaolevalt mikrotuubuleid inhibeeriva ühendi – disopüramiidi ja orüzaliini – toimet.Sisend näitab juure kasvunurga mõõtmiseks kasutatavat standardit.Tärnid näitavad olulisi erinevusi võltsraviga (t-test, lk< 0,05).n>19. Skaala riba = 1 cm.(b) Kortikaalsed mikrotuubulid epidermise rakkudes pikenemistsoonis.Mikrotuubulid metsiktüüpi Arabidopsis Col juurtes, mida kasvatati MS-plaatidel koos 25 μM KAND 11-ga või ilma, visualiseeriti immunohistokeemilise värvimisega, kasutades β-tubuliini primaarseid antikehi ja Alexa Fluor-konjugeeritud sekundaarseid antikehi.Skaalariba = 10 µm.c ) juurmeristeemi mikrotuubulite mitootiline struktuur.Mikrotuubulid visualiseeriti immunohistokeemilise värvimise abil.Mitootilised struktuurid, sealhulgas profaasitsoonid, spindlid ja fragmoplastid, loendati konfokaalsetest kujutistest.Nooled näitavad mitootilisi mikrotuubulite struktuure.Tärnid näitavad olulisi erinevusi võltsraviga (t-test, lk< 0,05).n>9. Skaalariba = 50 µm.
Kuigi Ursal on võime mikrotuubulite funktsiooni häirida, on selle toimemehhanism eeldatavasti erinev tüüpilistest mikrotuubuleid depolümeriseerivatest ainetest.Näiteks mikrotuubuleid depolümeriseerivate ainete, nagu disopüramiid ja orüzaliin, kõrgemad kontsentratsioonid kutsuvad esile epidermise rakkude anisotroopse laienemise, samas kui KAND 11 seda ei tee.Lisaks sellele põhjustas KAND 11 ja disopüramiidi kooskasutamine kombineeritud disopüramiidist põhjustatud juurekasvu reaktsiooni ja täheldati KAND 11 indutseeritud kasvu pärssimist (joonis S4).Samuti analüüsisime ülitundliku disopüramiidi 1-1 (phs1-1) mutandi vastust KAND 11-le. phs1-1-l on mittekanooniline tubuliini kinaasi punktmutatsioon ja see tekitab disopüramiidiga töötlemisel lühemaid juuri9,20.KAND 11 sisaldaval agarisöötmel kasvatatud phs1-1 mutantsete seemikute juured olid lühemad, mis sarnanesid disopüramiidil kasvatatud juurtega (joonis S5).
Lisaks täheldasime KAND 11-ga töödeldud seemikute juuremeristeemis mitootilisi mikrotuubulite struktuure, nagu profaasitsoonid, spindlid ja fragmoplastid. Kooskõlas CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS-i vaatlustega vähenes täheldati mitootiliste mikrotuubulite arvu (joonis .6c).
KAND 11 tsütotoksilisuse iseloomustamiseks subtsellulaarsel eraldusvõimel töötlesime tubaka BY-2 suspensioonrakke KAND 11-ga ja jälgisime nende reaktsiooni.Esmalt lisasime KAND 11 BY-2 rakkudele, mis ekspresseerivad TagRFP-TUA6, mis märgistab mikrotuubuleid fluorestseeruvalt, et hinnata KAND 11 mõju kortikaalsetele mikrotuubulitele.Kortikaalsete mikrotuubulite tihedust hinnati pildianalüüsi abil, mis kvantifitseeris tsütoskeleti pikslite protsendi tsütoplasmaatiliste pikslite hulgas.Analüüsi tulemused näitasid, et pärast 1-tunnist töötlemist 50 μM või 100 μM KAND 11-ga vähenes tihedus oluliselt, vastavalt 0,94 ± 0,74% või 0,23 ± 0,28%, samas kui DMSO-ga töödeldud rakkude tihedus oli 1,61 ± 0,61 % (joonis 7a).Need tulemused on kooskõlas Arabidopsise tähelepanekuga, et KAND 11 ravi kutsub esile kortikaalsete mikrotuubulite depolümerisatsiooni (joonis 6b).Samuti uurisime BY-2 liini GFP-ABD-märgistatud aktiini filamentidega pärast töötlemist sama kontsentratsiooniga KAND 11-ga ja täheldasime, et KAND 11 töötlemine katkestas aktiini filamentide toimimise.Töötlemine 50 μM või 100 μM KAND 11-ga 1 tund vähendas oluliselt aktiini filamendi tihedust vastavalt 1,20 ± 0,62% või 0,61 ± 0,26%, samas kui tihedus DMSO-ga töödeldud rakkudes oli 1,69 ± 0,51% (F ig 0,51).7b).Need tulemused on vastuolus propüsamiidi, mis ei mõjuta aktiini filamente, ja latrunkuliin B, aktiini depolümerisaatori, mis ei mõjuta mikrotuubuleid (SI joonis S6), mõjuga.Lisaks ei mõjutanud ravi kumamonamiidiga 1, kumamonamiidhappega 6 või KAND 11 mikrotuubuleid HeLa rakkudes (SI joonis S7).Seega arvatakse, et KAND 11 toimemehhanism erineb teadaolevate tsütoskeleti kahjustajate omast.Lisaks näitas meie KAND 11-ga töödeldud BY-2 rakkude mikroskoopiline vaatlus rakusurma algust KAND 11-ga ravi ajal ja näitas, et Evansi sinise värviga surnud rakkude osakaal ei suurenenud pärast 30-minutilist KAND 11-ravi oluliselt. pärast 90-minutilist töötlemist 50 μM või 100 μM KAND-iga suurenes surnud rakkude arv vastavalt 43,7% või 80,1%ni (joonis 7c).Kokkuvõttes näitavad need andmed, et uudne ursoolhappe derivaat KAND 11 on taimespetsiifiline tsütoskeleti inhibiitor, millel on varem teadmata toimemehhanism.
KAND mõjutab kortikaalseid mikrotuubuleid, aktiini filamente ja tubaka BY-2 rakkude elujõulisust.( a ) Kortikaalsete mikrotuubulite visualiseerimine BY-2 rakkudes TagRFP-TUA6 juuresolekul.KAND 11 (50 μM või 100 μM) või DMSO-ga töödeldud BY-2 rakke uuriti konfokaalse mikroskoopia abil.Kortikaalsete mikrotuubulite tihedus arvutati 25 sõltumatu raku mikrograafide põhjal.Tähed näitavad olulisi erinevusi (Tukey HSD test, lk< 0,05).Skaalariba = 10 µm.( b ) Kortikaalsed aktiini filamendid BY-2 rakkudes, mis on visualiseeritud GFP-ABD2 juuresolekul.KAND 11 (50 μM või 100 μM) või DMSO-ga töödeldud BY-2 rakke uuriti konfokaalse mikroskoopia abil.Kortikaalsete aktiini filamentide tihedus arvutati 25 sõltumatu raku mikrograafide põhjal.Tähed näitavad olulisi erinevusi (Tukey HSD test, lk< 0,05).Skaalariba = 10 µm.(c) Surnud BY-2 rakkude vaatlemine Evansi sinise värvimisega.KAND 11 (50 μM või 100 μM) või DMSO-ga töödeldud BY-2 rakke uuriti ereda välja mikroskoopiaga.n = 3.Skaalariba = 100 µm.
Uute loodustoodete avastamine ja rakendamine on toonud kaasa märkimisväärseid edusamme inimelu erinevates aspektides, sealhulgas meditsiinis ja põllumajanduses.Loodusvaradest kasulike ühendite saamiseks on tehtud ajaloolisi uuringuid.Eelkõige on aktinomütseedid teadaolevalt kasulikud nematoodide parasiitidevastaste antibiootikumidena, kuna nad suudavad toota mitmesuguseid sekundaarseid metaboliite, nagu avermektiini, ivermektiini ja bleomütsiini juhtühendit ja selle derivaate, mida kasutatakse meditsiiniliselt vähivastase ainena21, 22.Samuti on aktinomütseedidest avastatud mitmesuguseid herbitsiidseid ühendeid, millest mõnda kasutatakse juba kaubanduslikult1,23.Seetõttu peetakse tõhusaks strateegiaks aktinomütseedi metaboliitide analüüsi soovitud bioloogilise aktiivsusega looduslike saaduste eraldamiseks.Selles uuringus avastasime S. werraensis'est uue ühendi kumamonamiidi ja sünteesisime selle edukalt.Ursoonhape on urbenamiidi ja selle derivaatide sünteetiline vaheühend.See võib põhjustada iseloomulikku juurte kõverdumist, avaldada mõõdukat kuni tugevat herbitsiidset toimet ja kahjustada otseselt või kaudselt taimede mikrotuubuleid.Siiski võib urmotoonhappe toimemehhanism erineda olemasolevate mikrotuubulite inhibiitorite omast, kuna KAND 11 lõhub ka aktiini filamente ja põhjustab rakusurma, mis viitab regulatiivsele mehhanismile, mille abil urmotoonhape ja selle derivaadid mõjutavad paljusid tsütoskeleti struktuure..
Urbenoonhappe edasine üksikasjalik iseloomustus aitab paremini mõista urbenoonhappe toimemehhanismi.Eelkõige on järgmiseks eesmärgiks hinnata ursonhappe võimet seonduda redutseeritud mikrotuubulitega, et teha kindlaks, kas ursonhape ja selle derivaadid toimivad otse mikrotuubulitele ja depolümeriseerivad neid või kas nende toime põhjustab mikrotuubulite destabiliseerumist.Lisaks aitab juhul, kui mikrotuubulid ei ole otsene sihtmärk, ursonhappe toimekoha ja molekulaarsete sihtmärkide tuvastamine taimerakkudel paremini mõista seotud ühendite omadusi ja võimalikke viise herbitsiidse toime parandamiseks.Meie bioaktiivsuse test näitas ursonhappe ainulaadset tsütotoksilist võimet selliste taimede nagu Arabidopsis thaliana, tubaka ja maksarohi kasvule, samas kui ei E. coli ega HeLa rakke mõjutatud.Loomarakkudele avalduv toksilisus on vähene või puudub üldse, ursoonhappe derivaatide eeliseks, kui need on välja töötatud herbitsiididena kasutamiseks avatud põllumajanduspõldudel.Tõepoolest, kuna mikrotuubulid on eukarüootides tavalised struktuurid, on nende selektiivne pärssimine taimedes herbitsiidide jaoks põhinõue.Näiteks propüsamiidi, mikrotuubulite depolümeriseerivat ainet, mis seondub otseselt tubuliiniga ja inhibeerib polümerisatsiooni, kasutatakse herbitsiidina selle vähese toksilisuse tõttu loomarakkudele24.Erinevalt disopüramiidist on sarnastel bensamiididel erinev sihtmärk-spetsiifilisus.Lisaks taimede mikrotuubulitele inhibeerib RH-4032 ehk bensoksamiid ka vastavalt loomarakkude või munarakkude mikrotuubuleid ning zalilamiidi kasutatakse fungitsiidina selle madala fütotoksilisuse tõttu25,26,27.Äsja avastatud karul ja selle derivaatidel on taimede suhtes selektiivne tsütotoksilisus, kuid väärib märkimist, et edasised modifikatsioonid võivad muuta nende sihtmärgispetsiifilisust, pakkudes potentsiaalselt täiendavaid derivaate patogeensete seente või munarakkude tõrjeks.
Urbenoonhappe ja selle derivaatide ainulaadsed omadused on kasulikud nende arendamiseks herbitsiididena ja uurimisvahenditena kasutamiseks.Tsütoskeleti tähtsus taimerakkude kuju kontrollimisel on laialdaselt tunnustatud.Varasemad uuringud on näidanud, et taimed on välja töötanud komplekssed mehhanismid kortikaalsete mikrotuubulite organiseerimiseks, kontrollides mikrotuubulite dünaamikat, et morfogeneesi korralikult kontrollida.On tuvastatud suur hulk molekule, mis vastutavad mikrotuubulite aktiivsuse reguleerimise eest, ja sellega seotud uuringud on endiselt käimas3, 4, 28.Meie praegune arusaam mikrotuubulite dünaamikast taimerakkudes ei selgita täielikult kortikaalsete mikrotuubulite organiseerimise mehhanisme.Näiteks kuigi nii disopüramiid kui ka oryzaliin võivad depolümeriseerida mikrotuubuleid, põhjustab disopüramiid tugevat juure moonutamist, samas kui oryzaliinil on suhteliselt kerge toime.Veelgi enam, mutatsioonid tubuliinis, mis stabiliseerib mikrotuubuleid, põhjustavad ka juurtes paremale pöörlemist, samas kui paklitakseel, mis stabiliseerib ka mikrotuubulite dünaamikat, seda ei tee.Seetõttu peaks ursoolhappe molekulaarsete sihtmärkide uurimine ja tuvastamine andma uusi teadmisi taimede kortikaalsete mikrotuubulite reguleerimisest.Samuti annavad tulevased võrdlused moonutatud kasvu soodustavate kemikaalide (nt disopüramiid) ja vähem tõhusate kemikaalide (nt orüzaliin või kumamotoorhape) võrdlused selle kohta, kuidas moonutatud kasv toimub.
Teisest küljest on kaitsega seotud tsütoskeleti ümberkorraldused veel üks võimalus ursonhappe tsütotoksilisuse selgitamiseks.Patogeeni nakatamine või esilekutsuja sisestamine taimerakkudesse põhjustab mõnikord tsütoskeleti hävimist ja sellele järgnevat rakusurma29.Näiteks on teatatud, et oomütseedist saadud krüptoksantiin häirib enne tubakarakkude surma mikrotuubuleid ja aktiini filamente, sarnaselt KAND-raviga 30, 31.Sarnasused kaitsereaktsioonide ja ursonhappe poolt indutseeritud rakuliste reaktsioonide vahel panid meid oletama, et need käivitavad ühiseid rakuprotsesse, kuigi on ilmne, et ursonhappe toime on kiirem ja tugevam kui krüptoksantiinil.Uuringud on aga näidanud, et aktiini filamentide katkemine soodustab spontaanset rakusurma, millega ei kaasne alati mikrotuubulite katkemist29.Lisaks tuleb veel näha, kas patogeen või esilekutsuja põhjustab moonutatud juurekasvu, nagu seda teevad ursoonhappe derivaadid.Seega on kaitsereaktsioonide ja tsütoskeleti ühendavad molekulaarsed teadmised atraktiivne probleem, millega tuleb tegeleda.Kasutades ära ursonhappega seotud madala molekulmassiga ühendite olemasolu, aga ka mitmesuguseid erineva võimsusega derivaate, võivad need anda võimaluse sihtida tundmatuid rakumehhanisme.
Kokkuvõttes pakub mikrotuubulite dünaamikat moduleerivate uute ühendite avastamine ja rakendamine võimsaid meetodeid taimerakkude kuju määramise aluseks olevate komplekssete molekulaarsete mehhanismide käsitlemiseks.Selles kontekstis võib hiljuti välja töötatud ühend urmotoonhape, mis mõjutab mikrotuubuleid ja aktiini filamente ning kutsub esile rakusurma, anda võimaluse dešifreerida seost mikrotuubulite kontrolli ja nende teiste mehhanismide vahel.Seega aitab urbenoonhapet kasutav keemiline ja bioloogiline analüüs mõista molekulaarseid regulatsioonimehhanisme, mis kontrollivad taime tsütoskeletti.
Inokuleerige S. werraensis MK493-CF1 500 ml segatud Erlenmeyeri kolbi, mis sisaldab 110 ml seemnesöödet, mis koosneb 2% (mass/maht) galaktoosist, 2% (mass/maht) essentspastast, 1% (mass/maht) baktokoostisest .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (mass/maht) maisi ekstrakt (KOGOSTCH Co., Ltd., Jaapan), 0,2% (w/v) (NH4)2SO4 ja 0,2% CaCO3 deioniseeritud vees.(pH 7,4 enne steriliseerimist).Külvikultuure inkubeeriti pöörleval loksutil (180 pööret minutis) 27 °C juures 2 päeva.Tootmise kasvatamine tahkes olekus kääritamise teel.Külvikultuur (7 ml) viidi 500 ml K-1 kolbi, mis sisaldas 40 g tootmissöödet, mis koosnes 15 g pressitud odrast (MUSO Co., Ltd., Jaapan) ja 25 g deioniseeritud veest (pH reguleerimata). enne steriliseerimist).).Kääritamine viidi läbi 30 °C juures pimedas 14 päeva.Fermentatsioonimaterjal ekstraheeriti 40 ml/pudel EtOH-ga ja tsentrifuugiti (1500 g, 4 °C, 10 min).Kultuuri supernatant (60 ml) ekstraheeriti 10% MeOH/EtOAc seguga.Orgaaniline kiht aurustati alandatud rõhul, et saada jääk (59,5 mg), millele viidi läbi HPLC gradientelueerimisega (0–10 minutit: 90%) pöördfaasikolonnis (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × pikkus 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minutit: 90% H2O/CH3CN kuni 70% H2O/CH3CN (gradient), 35–45 minutit: 90% H2O/EtOH, 45–155 minutit: 90% H2O /EtOH kuni 100% EtOH (gradient (gradient), 155–200 min: 100% EtOH) voolukiirusel 1,5 ml/min, kumamonamiid (1, 36,0 mg) eraldati valge amorfse pulbrina.
Kumamotoamiid (1);'H-NMR (500 MHz, CDC13) 8 6,93 (t, J = 2,5 Hz, IH), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz, IH), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1 H).), 4,08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDC13) 8 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ arvutatud väärtus: 141,0659, mõõdetud väärtus: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1593 cm-157.
Columbia seemned (Col-0) saadi Arabidopsise bioloogiliste ressursside keskusest (ABRC) loaga uurimistööks.Col-0 seemneid paljundati ja hoiti meie laboritingimustes ning neid kasutati metsiktüüpi Arabidopsise taimedena.Arabidopsise seemned steriliseeriti ja kultiveeriti pooltugevas Murashige ja Skoog söötmes, mis sisaldas 2% sahharoosi (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (mass/maht) 2-(4-morfolino)etaansulfoonhapet (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical ).) ja 1,5% agarit (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, temperatuuril 23 °C ja pidevas valguses.Phs1-1 mutandi seemned hankis T. Hashimoto (Nara teaduse ja tehnoloogia instituut).
Tüve SR-1 seemned hankis T. Hashimoto (Nara teaduse ja tehnoloogia instituut) ja neid kasutati metsikut tüüpi tubakataimedena.Tubakaseemnete pind steriliseeriti ja leotati steriilses vees kolm ööd, et soodustada idanemist, seejärel asetati poolkangesse lahusesse, mis sisaldas 2% sahharoosi, 0,05% (mass/maht) MES-i ja 0,8% gellaankummi (Fujifilm Wako Pure Chemical). Murashige.ja Skoogi sööde) pH 5,7 ja inkubeeriti 23 °C juures pideva valguse all.
Tüve Tak-1 andis T. Kohchi (Kyoto ülikool) ja seda kasutati maksarohu uuringu standardse katseüksusena.Gemma saadi steriliseeritud kultiveeritud taimedest ja plaaditi seejärel Gamborg B5 söötmele (Fujifilm Wako Pure Chemical), mis sisaldas 1% sahharoosi ja 0,3% gellaankummi, ning inkubeeriti 23 °C juures pideva valguse all.
Tubaka BY-2 rakud (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) hankis S. Hasezawa (Tokyo ülikool).BY-2 rakke lahjendati 95-kordselt modifitseeritud Linsmeieri ja Skoogi söötmes ja lisati kord nädalas 2,4-diklorofenoksüäädikhappega32.Rakususpensiooni segati pöördloksutil kiirusel 130 p/min temperatuuril 27 °C pimedas.Peske rakke 10-kordse mahu värske söötmega ja suspendeerige uuesti samas söötmes.BY-2 transgeensed rakuliinid, mis ekspresseerivad lillkapsa mosaiikviiruse 35S promootori all stabiilselt mikrotuubulimarkerit TagRFP-TUA6 või aktiini filamentmarkerit GFP-ABD2, genereeriti nii, nagu on kirjeldatud 33, 34, 35.Neid rakuliine saab hooldada ja sünkroniseerida, kasutades protseduure, mis on sarnased algse BY-2 rakuliini puhul kasutatavatele protseduuridele.
HeLa rakke kultiveeriti Dulbecco modifitseeritud Eagle'i söötmes (DMEM) (Life Technologies), millele oli lisatud 10% veise loote seerumit, 1,2 U/ml penitsilliini ja 1,2 μg/ml streptomütsiini 37 °C inkubaatoris 5% CO2-ga.
Kõik selles käsikirjas kirjeldatud katsed viidi läbi vastavalt Jaapani bioohutuse eeskirjadele ja juhistele.
Ühendid lahustati dimetüülsulfoksiidis (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) lähtelahustena ja lahjendati MS söötmes Arabidopsise ja tubakas või Gamborg B5 söötmes maksarohu jaoks.Juurekasvu pärssimise testi jaoks külvati näidatud ühendeid või DMSO-d sisaldavale agarisöötmele rohkem kui 10 seemet plaadi kohta.Seemneid inkubeeriti kasvukambris 7 päeva.Istikud pildistati ja juurte pikkus mõõdeti.Arabidopsise idanemistesti jaoks külvati 48 seemet plaadi kohta agarisöötmele, mis sisaldas 200 µM ühendit või DMSO-d.Arabidopsise seemneid kasvatati kasvukambris ja idanenud seemikute arv loendati 7 päeva pärast idanemist (dag).Tubaka idanemise testi jaoks külvati 24 seemet plaadi kohta agarisöötmele, mis sisaldas 200 µM KAND või DMSO.Tubakaseemneid kasvatati kasvukambris ja idanenud seemikute arv loendati 14 päeva pärast.Maksarohu kasvu pärssimise testi jaoks plaaditi igalt plaadilt 9 embrüot agarisöötmele, mis sisaldas näidatud kontsentratsioonides KAND-i või DMSO-d, ja inkubeeriti kasvukambris 14 päeva.
Kasutage juure meristeemi struktuuri visualiseerimiseks 5 mg/ml propiidiumjodiidiga (PI) värvitud seemikuid.PI-signaale jälgiti fluorestsentsmikroskoopia abil, kasutades TCS SPE konfokaalset laserskaneerivat mikroskoopi (Leica Microsystems).
Juurte histokeemiline värvimine β-glükuronidaasiga (GUS) viidi läbi vastavalt Malami ja Benfey36 kirjeldatud protokollile.Seemikud fikseeriti 90% atsetoonis üleöö, värviti 0,5 mg/ml 5-bromo-4-kloro-3-indolüül-β-d-glükuroonhappega GUS puhvris 1 tund ja pandi hüdraatunud klooraldehüüdi lahusesse.(8 g kloraalhüdraati, 2 ml vett ja 1 ml glütserooli) ning vaadeldi diferentsiaal-interferentskontrastmikroskoopia abil, kasutades mikroskoobi Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Juurenurgad mõõdeti vertikaalselt asetatud plaatidel kasvatatud 7-päevastel seemikutel.Mõõtke juure nurk gravitatsioonivektori suunas, nagu on kirjeldatud punktis 6.
Kortikaalsete mikrotuubulite paigutust täheldati nii, nagu kirjeldatud, protokolli väikeste muudatustega37.Primaarsete ja sekundaarsete antikehadena kasutati β-tubuliinivastast antikeha (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) ja Alexa Fluor 488-ga konjugeeritud hiirevastast IgG-d (Thermo Fisher Scientific: A32723) lahjendustes 1:1000 ja 1:100. vastavalt.Fluorestsentskujutised saadi TCS SPE konfokaalse laserskaneeriva mikroskoobi (Leica Microsystems) abil.Hankige Z-stack kujutisi ja looge maksimaalse intensiivsusega projektsioone vastavalt tootja juhistele.
HeLa rakkude proliferatsiooni test viidi läbi, kasutades rakkude loenduskomplekti 8 (Dojindo) vastavalt tootja juhistele.
E. coli DH5a kasvu analüüsiti rakkude tiheduse mõõtmisega kultuuris, kasutades spektrofotomeetrit lainepikkusel 600 nm (OD600).
Tsütoskeleti korraldust transgeensetes BY-2 rakkudes täheldati fluorestsentsmikroskoobi abil, mis oli varustatud CSU-X1 konfokaalse skaneerimisseadmega (Yokogawa) ja sCMOS-kaameraga (Zyla, Andor Technology).Tsütoskeleti tihedust hinnati kujutise analüüsiga, mis kvantifitseeris tsütoskeleti pikslite protsendi konfokaalsete piltide tsütoplasmaatiliste pikslite hulgas, kasutades ImageJ tarkvara, nagu kirjeldatud 38, 39.
Rakusurma tuvastamiseks BY-2 rakkudes inkubeeriti rakususpensiooni alikvooti 0,05% Evansi sinisega 10 minutit toatemperatuuril.Surnud rakkude selektiivne Evansi sinise värvimine sõltub värvaine ekstrusioonist elujõulistest rakkudest puutumata plasmamembraaniga40.Värvitud rakke jälgiti ereda välja mikroskoobi (BX53, Olympus) abil.
HeLa rakke kasvatati DMEM-is, millele oli lisatud 10% FBS, niisutatud inkubaatoris temperatuuril 37 °C ja 5% CO2-ga.Rakke töödeldi 100 µM KAND 11, kumamonaamhappe 6, kumamonamiidi 1, 100 ng/ml koltsemiidiga (Gibco) või 100 ng/ml Nocodmaze'iga (Sigma) 6 tundi temperatuuril 37 °C.Rakud fikseeriti MetOH-ga 10 minutit ja seejärel atsetaadiga 5 minutit toatemperatuuril.Fikseeritud rakke inkubeeriti 2 tundi β-tubuliini primaarse antikehaga (1D4A4, Proteintech: 66240-1), mis oli lahjendatud 0,5% BSA/PBS-is, pesti 3 korda TBST-ga ja seejärel inkubeeriti Alexa Fluor kitse antikehaga.488 1 tund.– Hiire IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) ja 15 ng/ml 4',6-diamidino-2-fenüülindooli (DAPI), mis on lahjendatud 0,5% BSA/PBS-is.Pärast kolmekordset pesemist TBST-ga vaadeldi värvitud rakke Nikon Eclipse Ti-E pööratud mikroskoobiga.Pildid jäädvustati jahutatud Hamamatsu ORCA-R2 CCD-kaameraga, kasutades tarkvara MetaMorph (Molecular Devices).
Postitusaeg: 17. juuni 2024